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分子伴侣表达载体构建及TEV蛋白酶突变体的功能分析

作　者: 亓振国
导　师: 范军
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 分子伴侣 TEV蛋白酶 定点突变 大肠杆菌
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


外源蛋白在大肠杆菌中重组表达时,常常会错误折叠或形成无功能的包涵体。有多种方法能用于改善外源蛋白的重组表达,最常用方法是与分子伴侣共表达或融合表达,但是后者需要高效的蛋白水解酶切除融合表达的分子伴侣。本研究,构建了含有多个大肠杆菌分子伴侣的辅助表达载体,分析了它们的功能；利用定点突变技术获得TEV蛋白酶(tobacco etch virus protease)突变体,并分析了体内和体外的活性,获得以下结果：1.克隆分子伴侣编码基因。克隆大肠杆菌分子伴侣基因dnaK、dnaJ、grpE、groEL、groES和clpB,测序结果表明克隆出的基因片段与GenBank公布的序列一致。2.构建分子伴侣表达载体。分别将分子伴侣基因插入pRSFDuet-1和pCDFDuet-1两个表达载体,构建成载体pR-GESP(含groEL、groES和grpE)和pC-DJCL(含dnaK、dnaJ和clpB)。3.转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示：groEL, groES, grpE, dnaK and clpB诱导表达的条带明显,但是未检测至dnaJ的表达条带。4.分析分子伴侣表达载体的效应。共表达结果显示,分子伴侣促进玉米西罗叶绿三酸：铁螯合酶和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的可溶性表达,但是对玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶的可溶性表达没有明显促进作用。5.改造TEV蛋白酶。以TEV蛋白酶S219V为原始体,定点突变疏水性氨基酸残基,获得两种TEV蛋白酶突变体(TEVQ protease, TEVF protease). SDS-PAGE显示TEV蛋白酶突变体的可溶性表达水平在重组大肠杆菌中有明显提高,每升菌液纯化获得约165 mg的重组TEVQ蛋白酶,108 mg的TEVF蛋白酶,明显高于报道的野生型TEV蛋白酶。6.分析了TEV蛋白酶的活体和离体活性。TEV蛋白酶与含有TEV酶切位点的融合蛋白共表达,电泳显示能有效切割融合蛋白,利用纯化的TEV酶,消化纯化的含有TEV蛋白酶酶切位点的融合蛋白,电泳显示它能有效切割靶蛋白,TEVQ蛋白酶的活性明显高于TEVF蛋白酶。综上所述,本文构建了两个分子伴侣辅助表达载体并分析了它们的表达水平。研究结果显示分子伴侣对改善不同外源蛋白可溶性表达的效率不同,与靶蛋白的内在性质有关；获得的TEV蛋白酶突变体,与报道的野生型相比,表达量得到很大提升,在体内和体外都具有较高的活性,为TEV蛋白酶在蛋白的可溶性表达及蛋白标签的应用奠定基础。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
文献综述  8-13
引言  13-15
  1 本课题的研究意义  13-14
  2 本研究的内容、目标  14-15
    2.1 研究内容  14
    2.2 研究目标  14-15
材料与方法  15-20
  1 材料  15
    1.1 质粒、菌株和试剂  15
    1.2 仪器  15
  2 方法  15-20
    2.1 大肠杆菌分子伴侣辅助表达载体构建  15-17
      2.1.1 引物设计  15-16
      2.1.2 分子伴侣基因扩增  16
      2.1.3 分子伴侣表达载体构建  16-17
      2.1.4 重组分子伴侣蛋白的表达检测  17
      2.1.5 分子伴侣表达载体的效应检测  17
      2.1.6 蛋白分析  17
    2.2 TEV蛋白酶突变体构建  17-20
      2.2.1 利用定点突变得到TEV蛋白酶突变体及序列比对  17
      2.2.2 TEV_Q蛋白酶与TEV_F蛋白酶可溶性及表达量比较  17-18
      2.2.3 TEV_Q蛋白酶突变体体内体外酶切  18-19
      2.2.4 TEV_Q蛋白酶突变体与TEV_F蛋白酶酶活性比较  19-20
结果与分析  20-26
  1 大肠杆菌分子伴侣辅助表达载体构建  20-24
    1.1 分子伴侣基因克隆  20
    1.2 分子伴侣表达载体构建  20-21
    1.3 分子伴侣基因表达  21-22
    1.4 分子伴侣辅助载体对玉米四吡咯分子合成的3个酶表达的作用  22-24
  2 TEV蛋白酶突变体构建  24-26
    2.1 利用定点突变得到TEV蛋白酶突变体及序列比对  24
    2.2 TEV_Q蛋白酶突变体与TEV_F蛋白酶可溶性比较  24-25
    2.3 TEV_Q蛋白酶突变体体内体外酶切  25
    2.4 TEV_Q蛋白酶突变体与TEV_F蛋白酶酶活性比较  25-26
讨论  26-29
结论  29-30
参考文献  30-40
致谢  40-41
作者简介  41

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 转化及克隆
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