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双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆表达及功能的初步研究

作　者: 叶若松
导　师: 魏华；万翠香
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物
关键词: 双歧杆菌 Serpin 克隆表达 HT-29细胞蛋白酶抑制黏附
分类号: R371
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 69次
引　用: 3次
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内容摘要

双歧杆菌是人体胃肠道的原籍菌和优势菌,通过与乳酸杆菌及其它厌氧菌一起共同占据肠粘膜表面,形成生物屏障,在维持肠道微生态平衡和促进宿主健康方面发挥了重要作用。黏附和免疫是双歧杆菌发挥重要生理作用的基础,然而,有关其黏附肠上皮细胞的作用机制和参与免疫作用的物质基础仍不甚清楚。目前有关黏附和免疫的研究主要集中在双歧杆菌的外膜蛋白上,而其中之一的Serine protease inhibitor (Serpin)蛋白,近三年引起了关注。Serpin是一类多肽类的丝氨酸蛋白酶抑制剂的总称,由350至500个氨基酸组成。在真核生物中,Serpin通过调节丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性,参与纤溶、炎症反应、细胞迁移、分化以及凋亡等许多重要的生命活动。然而,有关原核生物中Serpin的功能作用的报道甚少。2006年瑞士雀巢研究中心发现长双歧杆菌的Serpin蛋白可以有效抑制外源蛋白酶的活性,为双歧杆菌黏附于肠道提供条件。为研究Serpin在不同种属的双歧杆菌中的分布,从18株分属两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌的7个种的双歧杆菌中克隆到3个serpin基因,分别来源于B. infantis WBAN07、B. bifidum WBBI02和B. longum NCC2705,序列同源性为99.9%。序列分析表明这3个serpin基因存在8个碱基差异,其中B. infantis WBAN07中的149位和770位的序列改变导致了在B. longum NCC2705中组氨酸和谷氨酰胺均变成了精氨酸,而B. bifidum WBBI02中只有149位的碱基改变使得组氨酸转变为精氨酸。鉴于B. bifidum WBBI02的高粘附力,本实验重点对其Serpin的表达和生物学功能进行了初步研究,即从B. bifidum WBBI02克隆到去除两端疏水区域的serpin基因,构建原核表达载体pBX2-WBBI02。在25℃,0.2mM IPTG诱导3-4小时的条件下获得约32 kD的可溶性Serpin蛋白,使用NTA His-Bind树脂柱获得纯化的Serpin蛋白。活性研究的初步结果表明：Serpin在体外能有效地抑制糜蛋白酶和胰弹性蛋白酶的活性,最高抑制率分别为90%和97%,显微观察结果证实Serpin能促进双歧杆菌对HT-29细胞的粘附。Serpin克隆表达及其功能研究将为探讨Serpin在不同益生菌(双歧杆菌)中的功能和作用机制,奠定良好的试验基础,也必将为分析双歧杆菌其它细胞成分的黏附和免疫机理提供理论和方法学参考。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章 Serpin的研究进展  11-22
  摘要  11
  1.1 前言  11
  1.2 Serpin的命名和分类  11-12
  1.3 真核生物中Serpin的研究现状  12-16
    1.3.1 serpin基因结构  12
    1.3.2 Serpin的蛋白质结构  12-13
    1.3.3 Serpin的抑制机制  13-15
    1.3.4 真核生物中Serpin的研究进展  15-16
  1.4 原核生物中Serpin的研究现状  16
  1.5 双歧杆菌中Serpin的研究意义  16-18
  参考文献(References)  18-22
第二章双歧杆菌serpin基因的克隆  22-43
  摘要  22
  2.1 前言  22
  2.2 实验材料、设备与仪器  22-25
    2.2.1 实验材料  23-24
    2.2.2 仪器设备  24
    2.2.3 培养基  24
    2.2.4 试剂配制  24-25
  2.3 实验方法  25-35
    2.3.1 双歧杆菌基因组DNA的提取与检测  25-27
    2.3.2 serpin基因的扩增  27-28
    2.3.3 PCR产物的纯化  28
    2.3.4 目的基因与载体pMD18-T的连接  28-29
    2.3.5 转化  29-30
    2.3.6 阳性克隆子菌落PCR验证  30-31
    2.3.7 重组质粒的提取  31
    2.3.8 双酶切重组质粒鉴定阳性克隆  31-32
    2.3.9 测序  32
    2.3.10 DNA序列分析  32
    2.3.11 Southern印迹杂交DNA探针的标记(地高辛)  32-33
    2.3.12 DNA的限制性内切酶消化及转膜  33-34
    2.3.13 杂交与显色  34-35
  2.4 结果与分析  35-41
    2.4.1 基因组DNA的提取  36
    2.4.2 serpin基因的PCR扩增结果  36-37
    2.4.3 PCR产物回收结果  37
    2.4.4 阳性克隆子的验证  37-38
    2.4.5 serpin基因的单核苷酸多态性(SNP)分析  38-39
    2.4.6 基因组DNA酶切效果  39-40
    2.4.7 Southern印迹杂交结果  40-41
  2.5 讨论  41
  参考文献(References)  41-43
第三章 Serpin原核表达载体的构建及功能验证  43-61
  摘要  43
  3.1 前言  43
  3.2 实验材料、设备及试剂  43-45
    3.2.1 菌株及质粒  44
    3.2.2 实验仪器设备及试剂  44
    3.2.3 常用试剂  44-45
    3.2.4 培养基  45
  3.3 实验方法  45-52
    3.3.1 引物设计与serpin基因的扩增  45-46
    3.3.2 质粒DNA的提取  46
    3.3.3 双酶切及酶切产物纯化  46-47
    3.3.4 连接  47
    3.3.5 转化  47
    3.3.6 pBX_2-WBBI02阳性克隆子菌落PCR验证  47-48
    3.3.7 重组质粒pBX_2-WBBI02的提取  48
    3.3.8 双酶切表达载体鉴定插阳性克隆  48
    3.3.9 目标蛋白的诱导表达及优化  48-49
    3.3.10 SDS-PAGE凝胶的制备  49-50
    3.3.11 SDS-PAGE检测表达蛋白  50-51
    3.3.12 Serpin蛋白的纯化  51
    3.3.13 Serpin对糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制活性实验  51
    3.3.14 粘附实验  51-52
  3.4 结果  52-58
    3.4.1 Serpin的扩增结果  52-53
    3.4.2 pBX_2质粒的提取  53
    3.4.3 目的片段和表达载体双酶切产物的回收检测  53-54
    3.4.4 菌落PCR验证阳性克隆子  54-55
    3.4.5 表达载体质粒的提取与双酶切验证阳性克隆子  55
    3.4.6 SDS-PAGE检测表达蛋白  55-56
    3.4.7 Serpin蛋白的纯化结果  56-57
    3.4.8 Serpin糜蛋白酶和弹性蛋白酶的抑制活性检测  57
    3.4.9 Serpin促进双歧杆菌对HT-29细胞的粘附实验结果  57-58
  3.5 讨论  58-59
  参考文献(References)  59-61
第四章结论与建议  61-63
  4.1 结论  61-62
    4.1.1 双歧杆菌serpin基因的克隆和分析  61
    4.1.2 Serpin的表达与纯化  61-62
    4.1.3 Serpin的活性检测  62
  4.2 建议  62-63
致谢  63-64
附录A1 仪器设备  64-65
附录A2 试剂  65-67
附录B Serpin测序结果  67-71
个人介绍  71
已发表论文  71
待发表论文  71

双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆表达及功能的初步研究

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