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茶叶糖蛋白影响树突状细胞功能的研究

作　者: 韩澄
导　师: 谢明勇
学　校: 南昌大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 树突状细胞茶叶糖蛋白表型吞噬功能抗原提呈能力混合淋巴细胞反应细胞因子趋化因子
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

茶叶作为世界三大饮料(茶叶、可可、咖啡)之一,最早起源于中国,作为我国重要的农副产品,大量粗老茶叶以及相关工艺副产品一直未被很好的综合利用。大量研究发现茶叶中的多糖类成分具有增强机体免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂、降血压、抗艾滋、抗肿瘤、抗辐射等诸多生物活性。为了探讨茶叶糖蛋自(tea glycoprotein,TGP)的免疫增强药理机制,本研究建立应用小鼠骨髓来源树突状细胞(dendritic cells,DCs)为靶细胞的免疫活性.的筛选模型,在细胞水平研究是否具有免疫调节功能。现将本文主要研究结果概括如下：1.观察TGP对树突状细胞的前体细胞是否具有毒性。倒置显微镜法观察细胞形态；MTT法检测对细胞增殖率的影响；流式细胞仪测定细胞早期凋亡率。结果发现经TGP处理后树突状细胞的前体细胞生长状态良好、细胞生存率较高,对树突状细胞的前体细胞无明显凋亡影响,实验结果表明后续实验所采用的TGP无细胞毒性。2.建立以树突状细胞为靶细胞的TGP活性筛选模型。联合应用rmGM-CSF和rmIL-4诱导分化小鼠骨髓细胞,并采用MACS免疫磁珠法进一步纯化。通过细胞形态学及表面分子表达鉴定所得细胞,结果发现该方法可以获得大量高纯度稳定的树突状细胞,可应用于后续实验研究。3.应用该细胞活性筛选模型,初步探讨TGP的免疫调节作用。树突状细胞经TGP诱导刺激后的树突状细胞形态越发典型;其MHCⅡ、CD40 CD80、CD83和CD86的表达显著上调；其吞噬活性能明显降低。4.探讨不同实验剂量茶叶糖蛋白TGP对树突状细胞分泌功能的影响。结果发现,TGP能显著提高树突状细胞的NO分泌量(p<0.05),诱导树突状细胞分泌Thl型细胞因子IL-1β、IL-12p70以及趋化因子RANTES,与此同时对Th2型细胞因子IL-10分泌量抑制显著(p<0.01)。因此TGP可以调控树突状细胞分泌不同类型细胞因子和趋化因子,诱导机体趋向Thl型细胞免疫应答。5.探讨不同剂量茶叶糖蛋白TGP对树突状细胞活化T淋巴细胞功能的影响。结果显示,在适宜的DCs:T cells比例下,TGP可活化树突状细胞激活由OVA未致敏和致敏淋巴细胞增殖能力,树突状细胞的抗原提呈与诱导免疫应答功能均显著增强。通过ELISA法检测表明TGP可以上调树突状细胞促进T细胞分泌IL-2、IFN-γ和I[,-10细胞因子水平。6.探讨不同剂量TGP对树突状细胞趋化功能的影响。采用半定量PCR法检测树突状细胞表面趋化因子受体CCR7和CXCR4的mRNA表达水平。结果发现TGP可显著提高树突状细胞表面CCR7和CXCR4的mRNA表达,推测TGP对树突状细胞成熟的影响可能与趋化因子受体表达相关。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略语注释  7-13
第1章绪论  13-19
  1.1 引言  13
  1.2 树突状细胞生物学特性及其在药理活性中的研究  13-17
    1.2.1 树突状细胞的来源和分布  13-14
    1.2.2 树突状细胞的分化发育  14
    1.2.3 树突状细胞的供体来源及提取方法  14-16
    1.2.4 树突状细胞与肿瘤  16-17
  1.3 茶叶多糖生物活性研究进展  17
  1.4 本研究的目的意义、主要研究内容和创新性  17-19
    1.4.1 目的意义  17-18
    1.4.2 主要研究内容  18
    1.4.3 本研究的创新性  18-19
第2章茶叶糖蛋白的细胞毒性研究  19-25
  2.1 引言  19
  2.2 实验器材与仪器  19
    2.2.1 实验材料  19
    2.2.2 实验动物  19
  2.3 实验方法  19-21
    2.3.1 茶叶糖蛋白样品制备  19-20
    2.3.2 树突状细胞前体细胞的分离  20
    2.3.3 细胞形态学评价  20
    2.3.4 MTT法检测细胞增殖活性  20
    2.3.5 流式细胞仪检测细胞早期凋亡  20-21
    2.3.6 数据处理  21
  2.4 结果与分析  21-24
    2.4.1 茶叶糖蛋白对细胞形态的影响  21-22
    2.4.2 茶叶糖蛋白对树突状细胞前体细胞生长的影响  22-24
    2.4.3 细胞早期凋亡检测结果  24
  2.5 讨论  24
  2.6 本章小结  24-25
第3章树突状细胞的体外扩增培养、纯化及鉴定  25-29
  3.1 引言  25
  3.2 实验方法  25-26
    3.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞的体外诱导及培养  25
    3.2.2 小鼠骨髓来源树突状细胞的纯化  25
    3.2.3 瑞氏染色形态学鉴定  25-26
    3.2.4 流式细胞检测细胞表型  26
    3.2.5 数据处理  26
  3.3 结果与分析  26-28
    3.3.1 瑞氏染液细胞形态学观察  26-27
    3.3.2 细胞表面分子表达水平检测  27-28
  3.4 讨论  28
  3.6 本章小结  28-29
第4章茶叶糖蛋白对树突状细胞表型成熟及吞噬功能的影响  29-44
  4.1 引言  29
  4.2 实验方法  29-31
    4.2.1 鲎试剂检测样品细菌内毒素含量检测及去除  29
    4.2.2 MTT法检测样品对树突状细胞生长的影响  29-30
    4.2.3 细胞形态鉴定  30
    4.2.4 免疫染色和流式细胞分析  30
    4.2.5 吞噬实验  30-31
    4.2.6 数据处理  31
  4.3 结果与分析  31-43
    4.3.1 茶叶糖蛋白的内毒素含量  31-32
    4.3.2 茶叶糖蛋白对树突状细胞生长的影响  32
    4.3.3 TGP对树突状细胞形态的影响  32-34
    4.3.4 TGP对树突状细胞表面分子表达的影响  34-41
    4.3.5 TGP对树突状细胞吞噬功能的影响  41-43
  4.4 讨论  43
  4.5 本章小结  43-44
第5章茶叶糖蛋白对树突状细胞分泌功能的调控影响  44-53
  5.1 引言  44
  5.2 实验方法  44-45
    5.2.1 Griess法检测NO  44
    5.2.2 ELISA法检测细胞因子IL-12p70、IL-10及IL-1β  44
    5.2.3 ELISA法检测趋化因子RANTES  44-45
    5.2.4 数据处理  45
  5.3 结果与分析  45-52
    5.3.1 TGP对树突状细胞分泌炎症因子NO的影响  45-47
    5.3.2 TGP对树突状细胞分泌细胞因子的影响  47-51
    5.3.3 TGP对树突状细胞分泌趋化因子RANTES的影响  51-52
  5.4 讨论  52
  5.5 本章小结  52-53
第6章茶叶糖蛋白对树突状细胞激活T淋巴细胞的影响  53-61
  6.1 引言  53
  6.2 实验材料与仪器  53
    6.2.1 实验动物  53
  6.3 实验方法  53-55
    6.3.1 混合淋巴细胞反应(MLR)  53-54
    6.3.2 抗原提呈能力检测  54
    6.3.3 T淋巴细胞细胞因子分泌检测  54
    6.3.4 数据处理  54-55
  6.4 结果与分析  55-60
    6.4.1 TGP对树突状细胞诱导同种异体淋巴细胞增殖能力的影响  55
    6.4.2 TGP对树突状细胞诱导同基因T淋巴细胞增殖能力的影响  55-57
    6.4.3 TGP对MLR反应上清液Th1/Th2细胞因子的影响  57-60
  6.5 讨论  60
  6.6 本章小结  60-61
第7章茶叶糖蛋白对树突状细胞趋化作用的影响  61-67
  7.1 引言  61
  7.2 实验方法  61-64
    7.2.1 总RNA的提取  61
    7.2.2 总RNA的质量、浓度检测  61-62
    7.2.3 RNA的逆转录体系  62
    7.2.4 聚合酶链式反应(PCR)  62-63
    7.2.5 琼脂糖电泳  63
    7.2.6 数据处理  63-64
  7.3 结果与分析  64-66
    7.3.1 总RNA的质量、浓度检测  64
    7.3.2 RT-PCR产物的电泳结果  64-66
  7.4 讨论  66
  7.5 本章小结  66-67
第8章结论及展望  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-75
攻读学位期间的研究成果  75

茶叶糖蛋白影响树突状细胞功能的研究

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