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目的:骨质疏松症(PMOP)是一种多病因的增龄性病变,它的主要临床表现为腰背髋部疼痛,弯腰,驼背,身高变矮,轻微外伤就可以造成骨折。它基本病理机制是骨代谢过程中破骨细胞(OC)的骨吸收增加与成骨细胞(OB)的骨形成减少,从而导致人体内的钙磷代谢不平衡,骨密度(Bone mineral density,BMD)逐渐降低进而形成骨质疏松。骨质疏松可以分为两大类:绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。其中绝经后骨质疏松经济负担重,社会压力大,已成为严重的公共健康问题。绝经后骨质疏松的发病与绝经后雌激素分泌不足密切相关,临床上对绝经后PMOP经典的治疗方法是雌激素替代疗法(ERT),其疗效肯定,但长期应用有增加冠心病、子宫内膜癌、乳腺癌等发生的副作用,因此寻找更为理想的化合物治疗绝经后PMOP成为人们亟待解决的问题。近年来有报道称植物雌激素(phytoestrogen,PE)可以有效预防PMOP,同时也不伴有ERT的并发症。植物雌激素(phytoestrogen,PE)是主要存在于植物、水果和蔬菜中的一类天然的,结构及生物活性均类似于雌激素的非甾体类化合物,具有弱雌激素活性,为杂环多酚类化合物。PE可以与雌激素受体结合,对内源性雌激素起双向调节的作用,在改善围绝经期症状、降低血脂水平,防止骨质疏松等方面起着有益作用。以切除卵巢的授乳大鼠模型做实验,这些大鼠哺乳的幼鼠普遍存在骨量丢失,骨密度下降等症状。而喂养添加植物雌激素饲料的授乳幼鼠,骨密度明显增高,说明植物雌激素有预防骨质疏松的作用。植物雌激素与雌激素的作用相似,可与破骨细胞内的受体结合,抑制破骨细胞的活性;当与成骨细胞的受体结合时,可刺激成骨细胞分泌胶原酶,释放生长因子和细胞因子,增强成骨细胞的活性,促进骨质生长,加速骨形成,可有效地预防骨质疏松的形成。植物雌激素可以分为异黄酮类(Isoflavones),香豆素类(Coumarin)木脂素类(Lignans),黄酮醇类(Flavonol)等几类。根据以往的实验研究和文献报道发现不同种类的植物雌激素对成骨细胞均有促增殖与分化的作用,但是综合比较各类植物雌激素对成骨细胞作用方面的研究目前还没有人报道,本实验采用体外培养成骨细胞的方法,观察不同种类的植物雌激素对成骨细胞增殖与分化的影响;采用RT-PCR的技术,检测各类植物雌激素对成骨细胞分泌的I型胶原COL I mRNA,细胞内TGF-β信号转导分子smad4 mRNA和核结合因子runx2 mRNA表达的影响,在细胞水平比较各类植物雌激素对成骨细胞作用的强弱,以及其在分子水平作用机制的异同,以期为抗骨质疏松新药的筛选、研发以及联合用药提供实验依据。方法:1采用改良的组织块法分离培养新生(24 h内)SD大鼠颅骨成骨细胞。将不同浓度的四类植物雌激素(10-9 mol/L和10-7mol/L)加入到培养成骨细胞的培养基中,用倒置显微镜观察细胞形态和数量的改变。2采用噻唑蓝比色(MTT)法,以雌二醇(estrogen, E2)为阳性对照组,检测加药后,不同浓度的四类植物雌激素12 h,24 h,36 h对大鼠成骨细胞增殖的影响。3采用对硝基苯二钠基质动力学法(pNPP)法,以雌二醇为阳性对照组,检测不同浓度的四类植物雌激素在24 h,48 h,72 h对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。4采用放射免疫法(RIA)法,以雌二醇为阳性对照组,检测不同浓度的四类植物雌激素在24 h,48 h和72 h对大鼠成骨细胞骨钙素(BGP)水平的影响。5采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR ,RT-PCR)方法,检测大鼠成骨细胞在含10-7mol/L浓度的各类植物雌激素的培养基中培养48h后对I型胶原(COL I)mRNA,smad4 mRNA,runx2 mRNA的表达的影响。结果:1阳性对照组雌二醇对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响1.1阳性对照组雌二醇细胞形态学观察刚接种的成骨细胞成球形,悬浮于培养液中,逐渐沉降贴壁,24 h细胞贴壁展开。展开细胞形态不规则,呈多角形,培养72 h～96 h,细胞为长梭形、条索状,融合成片,分界较为模糊。培养96 h～120 h,细胞呈铺路石状态。如果再继续培养,细胞逐渐聚集形成细胞小结,随后胶原堆积,钙盐沉积,形成不透光的矿化结节。连续培养20代,可见细胞体积增大,胞质稀薄,细胞分裂速度下降等一系列细胞衰老的表现。雌激素组与空白对照组相比,在72 h～96 h时,细胞更加密集,细胞间隙少,形态无明显差异。1.2阳性对照组雌二醇对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌二醇的无血清培养基中培养。浓度为1×10-7 mol/L时,培养24 h时有促增殖作用(P<0.01);浓度为1×10-9 mol/L时,12 h、24 h有促进大鼠成骨细胞增殖作用,其中12 h较为明显(P<0.01)。1.3阳性对照组雌二醇对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌二醇的无血清培养基中培养。培养24 h ,48 h ,72 h ,雌二醇组1×10-7 mol/L , 1×10-9 mol/L两个浓度组没有提高大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的作用(P>0.05)。1.4雌二醇组对大鼠成骨细胞分泌骨钙素(BGP)水平的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌二醇的无血清培养基中培养,在1×10-7mol/L浓度时: 48 h、72 h时,成骨细胞分泌骨钙素水平与空白组相比有统计学意义(P<0.05);浓度为1×10-9 mol/L时:24 h、72 h时,成骨细胞分泌骨钙素水平与空白组相比有统计学意义(P<0.05)。2四类植物雌激素组对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响2.1四类植物雌激素组细胞形态学观察与雌二醇组类似。2.2四类植物雌激素对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞分别在含补骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9 mol/L)的无血清培养基中培养,培养后与空白组比较。当植物雌激素的浓度为10-7 mol/L时:12 h ,大豆苷元和补骨脂素与空白组相比有促增殖作用;24 h ,大豆苷元,补骨脂素,山奈酚与空白组相比有促增殖作用;36 h ,五味子甲素与空白组相比有促增殖的作用。当植物雌激素的浓度10-9 mol/L时:12 h ,五味子甲素,补骨脂素与空白组相比有促增殖作用;24 h ,补骨脂素与空白组相比有促增殖的作用;36 h ,大豆苷元,五味子甲素,补骨脂素,山奈酚与空白组相比有促增殖作用。2.3四类植物雌激素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响大鼠成骨细胞分别在含补骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9 mol/L)的无血清培养基中培养,培养后与空白组比较。当植物雌激素的浓度为10-7 mol/L时:24 h ,五味子甲素与空白组相比较能提高碱性磷酸酶的活性;48 h,五味子甲素能提高碱性磷酸酶的活性;72 h ,山奈酚和大豆苷元能提高碱性磷酸酶的活性。当植物雌激素的浓度为10-9 mol/L时:24 h ,山奈酚,大豆苷元和五味子甲素能提高碱性磷酸酶的活性;48 h ,大豆苷元,五味子甲素,补骨脂素,山奈酚能提高碱性磷酸酶的活性;72 h ,山奈酚,五味子甲素能提高碱性磷酸酶的活性。2.4四类植物雌激素对大鼠成骨细胞分泌骨钙素(BGP)水平的影响大鼠成骨细胞分别在含补骨脂素(10-7或10-9 mol/L),五味子甲素(10-7或10-9 mol/L),山奈酚(10-7或10-9 mol/L),大豆苷元(10-7或10-9 mol/L),的无血清培养基中培养,培养后与空白组比较,浓度为10-7 mol/L时:24 h,大豆异黄酮,五味子甲素与空白组相比有统计学意义;48 h,五味子甲素与空白组相比有统计学意义;72 h,补骨脂素,五味子甲素与空白组相比有统计学意义。浓度为10-9 mol/L时:48 h ,山奈酚,补骨脂素,五味子甲素与空白组相比有统计学意义,补骨脂素的作用更明显;72 h,补骨脂素,五味子甲素与空白组相比有统计学意义。2.5四类植物雌激素对大鼠成骨细胞分泌的I型胶原(COL I) mRNA表达的影响。培养48 h,RT-PCR后,空白对照组COL I mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量0.209,大豆异黄酮的相对表达量为0.855;山奈酚的相对表达量为0.514,五味子甲素的相对表达量为0.465,补骨脂素的相对表达量为0.612,它们与空白对照组相比,能显著促进COL I mRNA的表达(P<0.01)。2.6四类植物雌激素对大鼠成骨细胞分泌的Smad4 mRNA表达的影响培养48 h, RT-PCR后,空白对照组Smad4 mRNA/GAPDH mRNA的相对表达量为0.372,大豆异黄酮的相对表达量为2.741,补骨脂素相对表达量为4.112,山奈酚相对表达量为2.845,五味子甲素相对表达量为1.317。它们与空白对照组相比能明显促进Smad4 mRNA的表达和空白组相比有统计学意义(P<0.01);各组之间存在明显差异。2.7四类植物雌激素对大鼠成骨细胞分泌的Runx2/Cbfa1 mRNA表达的影响培养48 h ,RT-PCR后,空白对照组Runx2/Cbfa1 mRNA /GAPDH mRNA的相对表达量为0.886,大豆苷元的相对表达量为1.090,补骨脂素相对表达量为0.476,山奈酚相对表达量为1.223,五味子甲素相对表达量为1.135,其中大豆苷元组,山奈酚组,五味子甲素组能明显的促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达,和空白组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:1从细胞水平上来看四类植物雌激素均对大鼠成骨细胞有促增殖与分化的作用,但是对大鼠成骨细胞影响的阶段和起效的时间不相同。2在增殖实验中,五味子甲素和补骨脂素的效果优于大豆苷元和山奈酚;在分化实验中,五味子甲素和山奈酚对分化早期指标碱性磷酸酶的效果较其它植物雌激素好;五味子甲素和补骨脂素对于分化晚期指标骨钙素的效果较其它种类植物雌激素好。3在细胞水平比较,总体来看补骨脂素和五味子甲素优于大豆苷元(大豆异黄酮之一),甚至接近或超过雌激素。这对防治骨质疏松化合物的筛选及研发有重要意义。4在分子水平研究发现各类植物雌激素影响的细胞因子不相同,反映了植物雌激素作用于成骨细胞的多途径性。5在分子水平的研究发现:大豆苷元对成骨细胞的作用影响的是I型胶原COL I mRNA的分泌,在这方面它优于其它类植物雌激素;补骨脂素主要影响的是smad4途径;山奈酚,五味子甲素,大豆苷元都对Runx2/Cbfa1 mRNA都有影响且效果类似,Runx2/Cbfa1可能是植物类雌激素作用的普遍因子。6四类植物雌激素在分子水平上的作用机制存在差异,这为植物雌激素治疗骨质疏松的配伍用药提供实验基础。
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