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骨靶向雌激素大黄酸哌嗪雌酚酮对人成骨细胞的作用及相关分子机制的研究

作　者: 朱雅琴
导　师: 李灵芝；王越
学　校: 河北医科大学
专　业: 药理学
关键词: 大黄酸哌嗪雌酚酮绝经后骨质疏松症骨保护素 NF-κB激活受体配体白细胞介素-6 雌激素受体雌激素反应元件有丝分裂原激活的蛋白激酶
分类号: R580
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:随着人类社会的老龄化,绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)已成为影响老年妇女生活质量的一种多发病,其首要病因是绝经后雌激素水平的降低。具有骨靶向性的雌激素类药物可以在治疗PMOP的同时避开雌激素对乳腺、卵巢等非靶器官的毒副作用,因此该类药物已经称为目前抗骨质疏松药物研究的热点之一。本室以骨靶向分子大黄酸为载体,雌酚酮为母体,合成了骨靶向雌激素大黄酸哌嗪雌酚酮(rhein-piperizinyl-estrone,命名为LC),前期研究已证实LC对去卵巢大鼠具有明显的抗骨质疏松活性,并能够显著促进原代培养的大鼠成骨细胞增殖和分化。本课题进一步研究了LC对人成骨样细胞MG-63的增殖、分化功能、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)/ NF-κB激活受体配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)/ NF-κB激活受体(receptor activator of NF-κB,RANK)系统以及白介素-6(interleukin-6,IL-6)及其受体表达的作用,并对其可能的作用机制进行了初步探讨。方法:1.MTT法检测MG-63细胞的增殖能力。2.流式细胞仪检测细胞周期。3.磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。4.逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测OPG、RANKL、IL-6及其受体(IL-6Rα、gp130)mRNA的表达水平。5.酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)检测IL-6蛋白的表达水平。6.免疫印迹(Western Blot)技术检测OPG、RANKL、IL-6Rα及gp130蛋白的表达水平。7.采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)分别对MG-63细胞的雌激素受体(estrogen receptor ,ER)α和ERβ基因进行沉默,G418筛选出阳性单克隆,扩大培养后用Western Blot技术分别鉴定出ERα或ERβ高、中抑制表达克隆用于研究LC对ER两种亚型的亲和力是否存在差异。8.应用荧光素酶报告基因检测法及3种有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)特异性信号阻断剂对LC作用的相关ER信号通路进行研究。结果:1. LC对人成骨样细胞MG-63生物学性能的影响LC能以剂量依赖方式显著促进人成骨样细胞MG-63增殖,并通过调控MG-63的细胞周期,使G1期细胞比例减少,G2+S期细胞比例增加进而促进细胞生长。LC通过增强MG-63细胞ALP的活性刺激成骨细胞分化成熟。LC能以剂量依赖方式显著上调MG-63细胞OPG mRNA及蛋白表达水平,显著下调RANKL mRNA和蛋白表达水平,100 nM LC的抑制作用最为显著。此外,LC尚能显著抑制MG-63细胞IL-6的转录水平和蛋白水平的表达;LC对IL-6RαmRNA的表达水平有抑制作用,而对蛋白水平的表达无作用;LC对gp130的转录水平和蛋白水平的表达均无影响。2. LC对成骨细胞作用的分子机制的研究ER阻断剂ICI182780(商品名为弗维司群,Fulvestrant)可完全阻断LC对成骨细胞的作用,表明LC经ER途径发挥作用。LC对ERα或ERβ高抑制表达细胞的作用无显著差异,提示LC对ER两种亚型的亲和力相似。LC显著增强ER基因启动子的转录活性,表明LC可通过经典的基因组作用机制即雌激素反应元件(Estrogen response element,ERE)基因转录途径发挥作用,同时MAPK特异性信号阻断剂PD98059(ERK抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、SB202190(p38MAPK抑制剂)也能够部分阻断LC的作用,表明LC的作用也依赖非基因组作用机制,即MAPK信号通路。结论:1.LC能够刺激人成骨细胞增殖、分化且通过调控细胞周期进而促进成骨细胞的生长。2.LC能够促进成骨细胞OPG的表达,抑制RANKL、IL-6的表达。3.LC经ER途径对成骨细胞发挥作用且其对ER的两个亚型ERα、ERβ没有选择性。4.LC是通过激活ERE基因转录途径和MAPK信号通路对成骨细胞发挥作用的。

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中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
英文缩写  9-11
研究论文骨靶向雌激素大黄酸哌嗪雌酚酮对人成骨细胞的作用及相关分子机制的研究  11-61
  前言  11-12
  材料与方法  12-32
  结果  32-38
  附图、附表  38-51
  讨论  51-58
  参考文献  58-61
综述 IL-6 与绝经后骨质疏松症的研究进展  61-73
  参考文献  67-73
个人简历  73

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