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SHP-1基因的表达及其对人乳腺癌细胞磷酸酶活性和增殖的影响

作　者: 谢亚琳
导　师: 罗荣城
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 乳腺癌 PTP SHP-1 磷酸酶活性
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤首位。有资料显示,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%-10%。据统计,全球每年有120～140万妇女患乳腺癌,约有50万患者死于该病。在我国妇女乳腺癌的发病率也以每年3%的速度逐年递增。乳腺癌严重影响了女性身心健康,甚至危及生命。如何有效地预防和治疗乳腺癌成为人们关注的焦点。随着现代分子生物学的发展,研究者们逐渐认识到在真核细胞信号传导过程中,通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰是信号通路调控的重要方式,两者之间的平衡在细胞正常信号转导及肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用。目前研究较多的是受体酪氨酸激酶(PTKSs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)。Ottenhoff-Kalff等发现在人类乳腺癌发生过程中,伴有细胞内磷酸化水平的失衡,主要是磷酸化水平升高,使细胞信号转导作用增强,从而导致肿瘤细胞的生长、分化、增殖。在调节细胞内磷酸化水平方面,酪氨酸激酶及酪氨酸磷酸酶起着非常重要的作用。受体酪氨酸激酶是最大的一类酶联受体。目前研究最热的是表皮生长因子受体家族(也称为HER家族),包括EGFR、HER2、HER3、HER4。HER家族受体在细胞膜上以无活性单体存在,一旦与配体结合,便可彼此结合形成10种不同的同源二聚体或异源二聚体。二聚体之间相互激活它们的蛋白激酶功能,进而激活多种不同的细胞信号转导途径,导致细胞增殖等。在乳腺癌患者中,20%～30%的患者存在HER2的高表达,这些HER2高表达的乳腺癌恶性程度高,易转移复发,患者的预后差。目前,针对HER家族的抗肿瘤分子靶向药物有以EGFR和/或HER2为靶点的药物主要是TKI(吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼)和单抗类(曲妥珠单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗等)。虽然TKI的临床应用取得了令人鼓舞的疗效,但是多数治疗有效的患者一年内出现耐药。深入研究揭示,HER家族分子间及其它受体分子间的交互激活作用导致HER家族蛋白的激酶活性不能被完全阻断,细胞内磷酸化水平升高的状态不能得到根本改善,是造成耐药的主要原因。其中HER3的活化是其治疗逃逸的重要因素。HER3缺乏蛋白激酶活性,但却具有转磷酸化作用。EGFR、HER2、c-Met等激酶分子可使HER3胞内区的酪氨酸磷酸化,然后HER3通过其转磷酸化作用直接激活PI3K/Akt等信号通路。TKI虽可以抑制肿瘤细胞中EGFR和HER2的自身磷酸化活性,但是HER3的这种转磷酸化活性却不受抑制,它不是TKI的直接靶点。HER3的存在对小分子靶向药物治疗模式提出了挑战。探讨新的解决思路,势在必行。在以PTK为靶点的药物出现耐药,治疗遇到瓶颈的时候,我们想到是否可以通过调控PTP来纠正细胞内的酪氨酸的过度磷酸化,恢复细胞原有的磷酸化平衡,使细胞维持自身的稳定呢?目前已分离纯化的PTPs家族成员有40多个,其中SHP-1基因被认为是近年来发现的重要候选抑癌基因之一,它在造血系统中的抑制白血病细胞生长的作用已经得到了证实。SHP-1蛋白为含SH2结构域的胞浆非受体酪氨酸磷酸酶,它通过直接去磷酸化作用调节细胞内信号蛋白分子酪氨酸的磷酸化水平,抑制细胞的有丝分裂、增殖、分化和生物活性。我们在前期工作中,分别检测了30例早期、HER-2阳性和转移性乳腺癌的标本,发现SHP-1的表达在HER-2阳性和转移性乳腺癌的标本中明显降低。我们推断这正是细胞增殖抑制信号异常的一种失平衡表现。HER-2表达升高和SHP-1表达下降,导致磷酸化及去磷酸化平衡破坏,磷酸化信号过度活化,细胞恶性程度及侵袭能力增加。SHP-1主要通过对生长因子受体或非受体蛋白酪氨酸激酶的脱磷酸作用起着重要的负性调节作用。目的：虽然SHP-1蛋白对肿瘤抑制功能已得到肯定,但其在乳腺癌细胞中的具体作用机制仍不十分清楚,其底物分子和表达的调控机制等也尚未完全明确。本研究通过转染并表达SHP-1基因,探讨SHP-1蛋白表达前后细胞内磷酸酶活性的变化及对乳腺癌细胞的生长活性的影响；构建原核表达载体,BL21大肠杆菌中表达GST融合蛋白,为下一步打下基础；构建pEGFP-C3-SHP-1 C/S突变载体,观察转染了pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S的乳腺癌细胞内磷酸酶活性的不同及细胞增殖的变化。方法：第一章SHP-1基因及突变体在真核细胞中的表达及活性分析1.真核荧光表达载体pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S的构建用HindⅢ、EcoRI对pcDNA3.1(+)-SHP-1重组质粒和pEGFP-C3质粒进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,目的基因胶回收后测定浓度,将SHP-1基因和pEGFP-C3质粒的胶回收产物用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化、铺板、挑选菌落,卡那霉素抗性LB培养基中扩增培养。行菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定。选取可见目的基因电泳条带的菌液样本继续扩增培养,提取质粒。将重组质粒命名为pEGFP-C3-SHP-1,对其进行酶切、电泳等初步鉴定,并经广州英俊公司测序。以pEGFP-C3-SHP-1为模板,以5’-CATCATCGTGCACAGCAGCGCCGGCA-3’为上游引物,5’ -ATGCCGGCGCTGCTGTGCACGATGATG-3’为下游引物,用Stratagene点突变试剂盒行点突变PCR,将PCR产物转化感受态细菌DH5a,37℃震荡培养过夜,提取质粒,命名为pEGFP-C3-SHP-1 C/S,经琼脂糖电泳及广州英俊公司测序鉴定。2. pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,用Lipofectamine2000介导pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株后,用G418筛选出稳定表达SHP-1和SHP-1C/S的细胞克隆。以pEGFP-C3空载体转染及未转染的MDA-MB-231细胞做对照。用于下一步鉴定及生物学实验。3.SHP-1和SHP-1 C/S基因表达的鉴定RT-PCR检测SHP-1和SHP-1 C/S基因在转染细胞中mRNA的表达水平；Western blot鉴定转染后SHP-1基因在转染细胞中的蛋白表达。4.转染并稳定表达SHP-1和SHP-1 C/S基因的细胞磷酸酶活性及细胞增殖能力的变化将转染了pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1 C/S质粒的MDA-MB-231细胞,以及转染了pEGFP-C3和未转染的MDA-MB-231细胞接种96孔板,培养24h。用无磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞,加入p-NPP作用底物,再加入1mmol/L的NaOH终止反应,测OD405值。用MTT法检测转染了SHP-1和SHP-1 C/S基因的乳腺癌细胞体外增殖能力的变化。第二章SHP-1基因在原核细胞中的表达研究1.原核表达质粒pReceiver-B03-SHP-1的构建将已有的pcDNA3.1 (+)-SHP-1重组质粒和pReceiver-B03质粒用KpnI和XhoI进行双酶切,琼脂糖电泳后胶回收SHP-1和pReceiver-B03片段,测浓度。将回收片段用T4连接酶连接(16℃,连接过夜)。连接体系转化BL21感受态菌,铺板,37℃孵育过夜。挑选克隆,氨苄抗性LB培养基37℃震荡培养过夜。提取质粒,酶切、电泳并测序鉴定。将重组质粒命名为pReceiver-B03-SHP-1。2.SHP-1蛋白原核表达的鉴定将转化了pReceiver-B03-SHP-1重组质粒和pReceiver-B03空质粒的BL21菌液,37℃过夜震荡培养。分别取上述菌液200ul加入10ml氨苄抗性LB培养基37℃震荡培养至OD值达0.6左右。取出上述菌液各5ml,分别加入IPTG至终浓度0.4mM诱导表达,与未加IPTG的菌液共同继续37℃震荡培养6hr。分别取出1ml上述菌液(共4个标本),12000rpm离心2min,弃上清,加入1%SDS混匀,煮沸10min,考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定。结果：第一章SHP-1基因及突变体在真核细胞中的表达及活性分析1.本实验构建了真核荧光表达载体pEGFP-C3-SHP-1和pEGFP-C3-SHP-1C/S,经提取质粒、酶切、琼脂糖电泳及测序等证实重组质粒构建成功。2.用脂质体转染法将真核荧光表达载体pEGFP-C3-SHP-1、pEGFP-C3-SHP-1C/S和pEGFP-C3转染MDA-MB-231细胞,分别用G418筛选建立了各自的稳定表达细胞株。3.RT-PCR及Western blot检测到SHP-1及SHP-1 C/S基因在其各自稳定表达细胞株中mRNA水平和蛋白水平均有表达。而作为对照的转染了pEGFP-C3空质粒和未转染的MDA-MB-231细胞中没有表达。4.转染了pEGFP-C3-SHP-1的MDA-MB-231细胞的磷酸酶活性明显增加,而转染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S和pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞与未转染MDA-MB-231细胞在磷酸酶活性活性方面无显著差异。MTT法绘制生长曲线显示,转染SHP-1基因的MDA-MB-231细胞其增殖明显降低,而转染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S和pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞与未转染的MDA-MB-231细胞之间的细胞增殖无显著差异。第二章SHP-1基因在原核细胞中的表达研究转化了原核表达载体pReceiver-B03-SHP-1的宿主菌BL21在IPTG的诱导下可以表达GST-SHP-1融合蛋白,并通过考马斯亮蓝染色和Western blot的方法得以证实。结论：1.转染了SHP-1和SHP-1 C/S的MDA-MB-231细胞分别用RT-PCI及Western blot的方法检测到SHP-1及SHP-1 C/S基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。而作为对照的转染了pEGFP-C3空质粒和未转染的MDA-MB-231细胞中没有表达。说明其稳定表达细胞株构建成功,为下一步实验做好了前期准备。2.转染了pEGFP-C3-SHP-1的MDA-MB-231细胞的磷酸酶活性明显增加,而转染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S和pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞与未转染MDA-MB-231细胞在磷酸酶活性活性方面无显著差异。说明转染的SHP-1基因是具有磷酸酶活性的,而SHP-1 C/S没有这个作用。3.MTT法绘制生长曲线显示,转染SHP-1基因的MDA-MB-231细胞其增殖明显降低,而转染了pEGFP-C3-SHP-1 C/S或pEGFP-C3的MDA-MB-231细胞与未转染MDA-MB-231细胞在细胞增殖方面无显著差异。提示SHP-1基因表达后对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖有抑制作用,而其突变体SHP-1 C/S不具有抑制增殖的作用。4.转化了原核表达载体pReceiver-B03-SHP-1的宿主菌BL21在IPTG的诱导下可以表达GST-SHP-1融合蛋白,为下一步研究打下基础。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-14
前言  14-19
第一章 SHP-1基因及突变体在真核细胞中的表达及活性分析  19-55
  1.实验材料与方法  19-39
  2.结果  39-49
  3.讨论  49-53
  参考文献  53-55
第二章 SHP-1基因在原核细胞中的表达研究  55-71
  1.材料与方法  55-62
  2.结果  62-67
  3.讨论  67-69
  参考文献  69-71
全文小结  71-72
中英文缩略词表  72-74
攻读硕士学位期间成果  74-75
致谢  75-78
统计学证明  78

SHP-1基因的表达及其对人乳腺癌细胞磷酸酶活性和增殖的影响

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