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雌激素和双酚A快速影响发育中大鼠海马NMDA受体活性及其机制

作　者: 罗清清
导　师: 徐晓虹
学　校: 浙江师范大学
专　业: 动物学
关键词: 雌激素双酚A 雌激素受体 NMDA受体亚基磷酸化 ERK1/2信号通路
分类号: R741
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

雌激素及各种类雌激素对脑发育及中枢神经系统的影响已引起人们的广泛重视。发育中的脑是对雌激素敏感的重要靶器官,雌激素可通过神经发生和脑源性神经营养因子、神经元突触可塑性和海马神经回路等影响学习记忆和认知功能,对大脑产生广泛影响。双酚A (bisphenol-A, BPA)作为一种常见的内分泌干扰物,可模拟雌激素作用对发育中的大脑产生影响。本实验室前期研究表明,围生期BPA暴露可引起雌雄小鼠发育期和成年期的多种神经行为改变,同时增强发育期仔鼠芳香化酶P450蛋白的表达,抑制雌激素受体β(Estrogen receptor beta, ERβ)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy-D-aspratate, NMDA)受体各亚基的表达。考虑到雌激素对脑的影响除了经典的基因调节机制外,还有快速核外机制的参与,本研究探讨了雌激素和BPA对发育期大鼠海马NMDA受体活性的快速作用,并对其可能机制进行了初步分析。方法：选取出生18天的清洁级Sprague-Dawley大鼠(与母鼠合笼饲养),苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate, EB,80μg/kg)经颈部皮下注射(subcutaneous injection, sc.),注射体积控制在0.05 ml左右,对照组注射等体积花生油。BPA实行腹腔注射(500μg/kg或者50μg/kg)给药,注射体积控制在0.2 ml左右,对照组注射等体积生理盐水。皮下注射和/或者腹腔注射15 min左右,经脑立体定位海马给予雌激素受体拮抗剂ICI 182,780或MEK1/2阻断剂U0126；对照组海马内注射等量人工脑脊液。EB或者BPA给药1 h后将动物断头处死,分离双侧海马组织,液氮冷冻保存后存于-80℃超低温冰箱内直至使用。采用Western blot方法,用NR1, NR2B, ERβ,磷酸化NR2B, ERK,磷酸化ERK等兔来源多克隆抗体来检测相应的蛋白表达。结果：1.外周给予EB或BPA后1 h,出生18 d雄性大鼠海马NMDA受体亚基NR1和NR2B蛋白表达和ERB蛋白表达没有变化；然而,NMDA受体亚基NR2B磷酸化的表达显著增加(P<0.01)。EB或BPA对发育期雌性大鼠NMDA受体亚基NR1、NR2B、磷酸化NR2B和ERβ蛋白的表达也有类似的作用。这一结果提示急性给予EB或BPA并不影响NMDA受体NR1和NR2B亚基和ERβ蛋白表达,但可快速促进NR2B亚基的磷酸化；且这一作用没有性别差异。2.为了分析EB和BPA快速促进NR2B亚基磷酸化是否通过膜相关的雌激素受体进行,在外周给予EB或BPA 15 min后,海马内注射雌激素受体拮抗剂ICI 182,780以阻断雌激素受体(estrogen receptor, ER)的活性。结果显示用ICI 182,780预处理可显著抑制由EB或BPA诱导的NR2B亚基磷酸化水平增加(P<0.01),表明EB或BPA诱导的快速NR2B亚基磷酸化是通过膜相关的雌激素受体介导,因为基因调节机制需要更长的时间。3.外周给予EB或BPA 1 h,并不影响出生18天雄性大鼠海马ERK1/2蛋白表达,但能显著提高ERK1/2的磷酸化水平(P<0.01),表明EB和BPA都可快速激活ERK1/2信号转导通路。进一步用雌激素受体拮抗剂ICI 182,780预处理,可明显抑制EB或BPA诱导的ERK1/2磷酸化(P<0.01),表明EB或BPA可能通过膜雌激素受体诱导ERK1/2蛋白磷酸化。4.为了进一步分析EB或BPA快速诱导NMDA受体NR2B亚基的磷酸化的信号途径,在外周给予EB或BPA 15 min后,海马内注射特异性MEK1/2 (mitogen-activated, ERK-activating kinase1/2)阻断剂U0126。结果显示U0126显著抑制EB或BPA诱导的ERK1/2蛋白磷酸化和NR2B亚基蛋白磷酸化水平的增强(P<0.01)。这表明EB或BPA诱导的发育中雄性大鼠海马NMDA受体NR2B亚基磷酸化水平的快速增加需要激活ERK1/2,提示MAPK/ERK信号转导通路参与了雌激素或BPA快速激活NMDA受体NR2B亚基的磷酸化。5.虽然单独外周给予BPA的作用与EB相似,都能使NMDA受体亚基NR2B磷酸化水平显著增强,然而,EB和BPA共同给药时,NR2B亚基磷酸化水平较EB或BPA单独作用都有显著降低(P<0.01),表明雌激素和BPA共同作用时产生拮抗作用。结论：EB和BPA可快速提高NMDA受体NR2B亚基的磷酸化水平,该作用可能通过膜相关的雌激素受体介导,并经MAPK/ERK信号转导通路进行。同时,雌激素和BPA共同存在时可能产生拮抗作用。雌激素或BPA对NMDA受体NR2B亚基的的快速磷酸化作用可能会影响海马树突棘密度和突触可塑性,并因此广泛影响脑功能。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
符号说明  11-12
第一章绪论  12-26
  1 雌激素对脑发育的调节及双酚A的影响  12-14
  2 雌激素受体:核受体与膜受体  14-17
  3 雌激素对脑发育的调节:基因组效应与非基因组效应  17-23
  4 雌激素调节脑发育与NMDA受体  23-24
  5 课题研究的目的和意义  24-26
第二章雌激素和双酚A对雌激素受体β、NMDA受体亚基及其磷酸化的影响  26-35
  1 引言  26
  2 材料与方法  26-30
  3 结果  30-32
  4 讨论  32-35
第三章雌激素膜相关受体参与雌激素或双酚A对NR2B磷酸化的影响  35-39
  1 引言  35
  2 材料与方法  35-36
  3 实验结果  36-37
  4 讨论  37-39
第四章雌激素或双酚A快速增强海马内ERK1/2磷酸化水平  39-43
  1 引言  39
  2 材料与方法  39-40
  3 结果  40-42
  4 讨论  42-43
第五章 MAPK/ERK通路参与雌激素或双酚A对NR2B蛋白磷酸化的影响  43-46
  1 引言  43
  2 材料与方法  43
  3 结果  43-45
  4 讨论  45-46
第六章结论  46-47
第七章展望  47-48
参考文献  48-66
致谢  66-67
攻读学位论文期间发表的学术论文目录  67-68

雌激素和双酚A快速影响发育中大鼠海马NMDA受体活性及其机制

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