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脂质纳米粒的制备及基因转染研究

作　者: 张微
导　师: 袁弘
学　校: 浙江大学
专　业: 药剂学
关键词: 脂质纳米粒 鱼精蛋白 质粒DNA 基因转染 三元纳米粒
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 254次
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内容摘要


脂质纳米粒（Lipid Nanoparticles,LN）主要包括固体脂质纳米粒（solid LipidNanoparticles,SLN）和纳米结构脂质载体（Nanostructured Lipid Carriers,NLC）,是近年来研究十分活跃的靶向缓控释胶粒给药系统之一。本研究以乙醇为有机相溶剂、泊洛沙姆188为表面活性剂,并用单硬脂酸甘油酯（Monosterain,MS）和硬脂胺（Octadecylamine,ODA）为脂质材料,通过水性溶剂扩散法制备阳离子固体脂质纳米粒,在单硬脂酸甘油酯中加入液态的油酸（Oleic Acid,OA）或者聚乙二醇单硬脂酸酯（Polyethylene Glycolmonostearate,PEG2000-SA）,制备OA-NLC或者PEG-SLN。制备得到的SLN粒径在100 nm以下,加入OA或者PEG后,其粒径变化不大。将脂质纳米粒与HEK293细胞共孵育,结果表明,SLN的摄取情况较好,1 h后就有明显的细胞摄取,脂质纳米粒配方中加入OA或者PEG后,细胞摄取增加。将适宜比例的鱼精蛋白/DNA二元复合物与SLN或者NLC复合,制备三元纳米粒,用于基因转染。SLN/鱼精蛋白/DNA三元转染系统中,当SLN和DNA的质量比从16:3增加到80:3时,三元纳米粒的粒径从188.50±0.26 nm增加到259.33±3.44 nm,电位从25.50±3.30 mV增加到33.40±2.80 mV。在含血清的培养条件下,当三元纳米粒中的固体脂质纳米粒（ODA质量比为15%的固体脂质纳米粒）和DNA的质量比达到50:3的时候,三元纳米粒的转染效率最高（26.13±5.22%）;当SLN和DNA的质量比高于50:3,或者SLN中ODA的含量超过20%后,可能由于三元复合物的毒性增强,导致转染效率降低。与脂质体lipofectamineTM 2000比较,三元纳米粒的基因表达更为持续,而且在有血清存在的条件下表达更稳定。采用含有不同OA和PEG比例的OA-NLC或者PEG-SLN,制备三元复合物纳米粒基因转染系统。形成的三元纳米粒粒径均在200 nm左右,表面电位都为负值。在含血清的环境中,当OA-NLC/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒中的NLC（油酸质量比为20%的NLC）和DNA的质量比达到65:3的时候,转染效率最高（虫荧光素酶基因表达量为（2.27±0.32）*106 RLU/mg蛋白）,这可能与该比例下纳米粒的细胞摄取较多有关,而相同条件下脂质体虫荧光素酶基因表达量为（3.63±0.50）*105 RLU/mg蛋白。和脂质体lipofectamineTM 2000/DNA二元复合物相比较,三元纳米粒能够在血清环境中更为持续地进行表达,而且其细胞毒性很小,HEK293细胞半致死浓度均在300μg/mL。SLN用PEG修饰后,HEK293细胞摄取增加。且随着处方中PEG量的增加,摄取增加,细胞转染结果显示,血清条件下PEG修饰的SLN在HEK293细胞系转染（虫荧光素酶基因表达量为（2.22±0.16）*106 RLU/mg蛋白）比无血清条件下显著增强,而血清存在条件下脂质体的虫荧光素酶基因表达量为（1.71±0.20）*105RLU/mg蛋白。

全文目录


致谢  5-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
引言  13-15
1.SLN/鱼精蛋白/DNA三元复合物的制备及基因转染  15-33
  1.1 材料与仪器  15-16
    1.1.1 材料  15-16
    1.1.2 仪器  16
  1.2 实验方法  16-20
    1.2.1 SLN的制备  16-17
    1.2.2 荧光标记物硬脂胺-异硫氰基荧光素嫁接物(ODA-FITC)的合成  17
    1.2.3 荧光标记固体脂质纳米粒的制备  17
    1.2.4 鱼精蛋白/DNA复合物和三元纳米粒的制备与理化性质考察  17
    1.2.5 表面结构的观察  17-18
    1.2.6 凝胶阻滞实验  18
    1.2.7 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  18
    1.2.8 体外基因转染实验  18-19
    1.2.9 细胞生长抑制实验  19
    1.2.10 DNA的细胞摄取和三元复合物的细胞内定位  19-20
    1.2.11 数据分析  20
  1.3 结果和讨论  20-32
    1.3.1 脂质纳米粒的粒径电位  20
    1.3.2 SLN/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的制备及理化性质考察  20-23
    1.3.3 凝胶阻滞实验  23
    1.3.4 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  23-25
    1.3.5 体外基因转染  25-28
    1.3.6 细胞生长抑制实验  28-29
    1.3.7 脂质纳米粒的细胞摄取和细胞内定位  29-32
  1.4 小结  32-33
2.NLC/鱼精蛋白/DNA三元复合物的制备及基因转染  33-49
  2.1 试剂与仪器  33-34
    2.1.1 试剂  33-34
    2.1.2 仪器  34
  2.2 实验方法  34-37
    2.2.1 纳米结构脂质载体(NLC)的制备  34-35
    2.2.2 荧光标记纳米结构脂质载体的制备  35
    2.2.3 NLC/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的制备及性质考察  35
    2.2.4 表面结构的观察  35
    2.2.5 凝胶阻滞实验  35-36
    2.2.6 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  36
    2.2.7 体外基因转染实验  36
    2.2.8 细胞毒性测定  36-37
    2.2.9 NLC的细胞摄取  37
    2.2.10 数据分析  37
  2.3 结果与讨论  37-48
    2.3.1 NLC/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的制备及粒径电位测定  37-38
    2.3.2 SLN/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的表面形态观察  38-39
    2.3.3 凝胶阻滞实验  39
    2.3.4 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  39-41
    2.3.5 体外基因转染  41-45
    2.3.6 细胞生长抑制实验  45-46
    2.3.7 NLC的细胞摄取实验  46-48
  2.4 小结  48-49
3.PEG-SLN/鱼精蛋白/DNA三元复合物的制备及基因转染  49-60
  3.1 试剂与仪器  49-50
    3.1.1 试剂  49-50
    3.1.2 仪器  50
  3.2 实验方法  50-53
    3.2.1 PEG-SLN的制备  50-51
    3.2.2 荧光标记PEG-SLN的制备  51
    3.2.3 PEG-SLN/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的制备及性质考察  51
    3.2.4 PEG修饰的三元纳米粒形态观察  51
    3.2.5 凝胶阻滞实验  51-52
    3.2.6 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  52
    3.2.7 体外基因转染实验  52
    3.2.8 细胞毒性测定  52-53
    3.2.9 PEG-SLN的细胞摄取  53
    3.2.10 数据分析  53
  3.3 结果和讨论  53-59
    3.3.1 PEG-SLN/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的制备及粒径电位测定  53-54
    3.3.2 SLN/鱼精蛋白/DNA三元纳米粒的表面形态观察  54
    3.3.3 凝胶阻滞实验  54-55
    3.3.4 脱氧核糖核酸酶Ⅰ保护实验  55-56
    3.3.5 细胞生长抑制实验  56
    3.3.6 PEG-SLN的细胞摄取实验  56-57
    3.3.7 体外基因转染  57-59
  3.4 小结  59-60
结论  60-62
参考文献  62-68
综述:三元基因转染系统  68-90

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学
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