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桃叶片及草莓果实中VIGS体系的建立

作　者: 贾海锋
导　师: 沈元月
学　校: 北京农学院
专　业: 果树学
关键词: 烟草脆裂病毒(TRV) 基因沉默桃叶片,草莓果实 CHLH基因
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

病毒诱导基因沉默是利用RNA介导病毒防卫机制的一项技术,构建含有目的基因片段的人工改造病毒载体,通过农杆菌侵染导致植物内源目的基因沉默。为建立病毒诱导基因沉默体系,选用烟草脆裂病毒(TRV)和烟草为实验材料,构建了镁离子螯合酶H亚基(CHLH)的基因沉默病毒载体,病毒载体侵染结果显示目的基因(CHLH)沉默导致桃幼苗叶片出现光漂白现象和草莓白色果实的发育停止现象,采用半定量和荧光定量的方法检测目的基因CHLH的沉默效果,结果显示CHLH基因mRNA被显著降解,该体系的建立有利于将来对植物基因进行高通量功能分析。和在模式植物上的研究进展相比,由于转基因操作的难度,分子生物学在果树方面的研究进展已经非常落后。因此,探索出一个高效的基因操作系统,在果树学上有着非常特殊的意义。在本论文中,我们主要介绍病毒诱导基因沉默技术在桃树(Prunus persica)及草莓上用于基因功能分析的情况。已从桃树及草莓中分别克隆出4,445 bp和4,312bp的cDNA序列,它是公认的编码镁离子螯合酶H亚基的cDNA,这种镁螯合酶功能缺失时伴随黄色或白色现象出现。为了建立基因沉默技术,分别选择了桃和草莓CHLH基因的一个650 bp左右的cDNA片段用于构建CHLH基因沉默体系,并克隆到病毒载体pTRV2中。pTRV1, pTRV2和它的重组质粒pTRV2-PpCHLH(650bp)分别经冻融法被转到农杆菌GV3101中。重组体的农杆菌混合物通过50ml注射针筒侵染4-5周桃树苗和通过草莓果实蒂部注入果实中。桃苗侵染15天后,受侵染部位出现褪色,最后变为黄色或白色,和CHLH失去功能相一致。草莓果实在侵染8天后,出现果实不上色现象,半定量RT-PCR法,荧光定量RT-PCR法和Northern杂交检验,都表明CHLH基因的表达被沉默,说明诱导病毒基因沉默技术在桃树及草莓果实中获得了成功。这将有助于推动分子生物学在果树上的研究。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
第一章引言  7-11
  1.1 病毒诱导基因沉默的进展  7-8
  1.2 VIGS的机理  8
  1.3 烟草脆裂病毒载体TRV  8-9
  1.4 ABAR/CHLH基因的研究进展  9-11
第二章桃叶片VIGS体系的建立  11-28
  2.1 引言  11
  2.2 材料与试剂  11-13
  2.3 实验方法  13-20
  2.4 结果与分析  20-26
  2.5 小结  26-28
第三章草莓果实VIGS体系的建立  28-49
  3.1 引言  28
  3.2 材料与试剂  28-29
  3.3 实验方法  29-34
  3.4 结果与分析  34-49
第四章结论  49-50
  4.1 桃叶片和草苟果实条件的探索  49
  4.2 本研究的创新点  49
  4.3 研究与展望  49-50
参考文献  50-53
致谢  53-54
作者简历  54

桃叶片及草莓果实中VIGS体系的建立

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