学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

TRBP在RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的作用研究

作　者: 韩涛
导　师: 杨安钢；张勇
学　校: 第四军医大学
专　业: 免疫
关键词: TRBP RISC miRNA 转录后基因沉默
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 131次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


TRBP全长366aa,属于dsRNA结合蛋白家族,具有3个dsRBD,位于dsRBD2内部的KR-螺旋模序负责RNA结合,第三个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用。1991年,TRBP首先作为HIV-1反式激活应答RNA结合蛋白被分离鉴定出来,它具有多种生物学功能,包括调控精子生成与发育、抑制PKR激活、调节HIV-1基因表达、参与RNAi过程等。TRBP是PKR的强抑制物,它通过直接结合和dsRNA扣押而发挥作用。TRBP不依赖PKR而依赖结构RNA,对翻译也有直接作用。TRBP促进HIV-1的表达和复制,在星形胶质细胞中PKR的高应答导致了HIV-1的低复制和病毒结构蛋白的翻译低下,而TRBP抑制PKR激活,使病毒蛋白产生恢复,从而增强了HIV复制。研究表明TRBP通过对抗PKR介导的抗病毒免疫而在病毒翻译中具有关键作用。2005年,刊登在Nature和EMBO的两篇文章报道说TRBP与作为RISC组分的Dicer相结合,TRBP、Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中发挥作用。TRBP在dsRNA和Dicer之间募集Ago2时起到桥梁作用, TRBP或Dicer缺失后成熟miRNA产生减少和siRNA功能的丧失,他们推断TRBP募集Ago2到Dicer,将RNAi的启动和执行阶段相偶联。TRBP与RNaseⅢ家族成员Dicer相互作用,并结合dsRNA,随后结合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白,它们共同组成RISC复合体。dsRNA的一条链被递呈给Ago2蛋白从而导致siRISC和miRISC的产生。但是,TRBP哪个结构域在RNAi中发挥作用以及以哪个结构域与Ago2相互作用尚未完全阐明。为了进一步探讨TRBP与Ago2间的相互作用,我们用PCR方法克隆了TRBP全长基因,构建了只含有两个dsRNA结合结构域的截短/重组基因TAB、TAC和TBC,并克隆入真核表达载体pFlag-CMV4中,经DNA测序,证实获得序列正确,分别命名为pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC。将pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC质粒分别瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞,在转染细胞中检测到了目的基因的表达。各质粒分别转染人宫颈癌HeLa细胞,并稳定建株,裂解细胞通过免疫共沉淀检测TRBP全长及其截短/重组体分子与Ago2、Dicer分子的相互作用,发现全长及各截短/重组体分子均与Ago2、Dicer分子存在相互作用。我们用实时定量PCR和Western blot的方法对细胞系进行了筛选,证实了TRBP在胶质瘤细胞系中低表达。双荧光素检测表明,TRBP低表达的胶质瘤细胞系U251、C6、U87、和SHG44 RNA干扰作用降低。同样,利用干扰β-Actin的siRNA瞬时转染HeLa细胞和U251细胞,发现TRBP低表达的U251细胞干扰作用降低。综上所述,我们构建了TRBP全长及其截短/重组体真核表达载体,并初步检测了其功能,为进一步研究其功能机制奠定了基础。

全文目录


缩略语表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-14
文献回顾  14-30
  第一部分 miRNA 的研究进展  14-23
  第二部分 TRBP 研究进展  23-29
  展望  29-30
正文  30-57
  实验材料  30-36
  实验方法  36-43
  结果  43-54
    一、TRBP 及其截短/重组体真核表达载体的构建  43-48
    二、TRBP 及其截短/重组体分子在 HeLa 细胞中的表达  48
    三、TRBP 及其截短/重组体分子与 RISC 组份间的相互作用  48-49
    四、TRBP 分子在不同细胞系中的表达  49-51
    五、TRBP 表达水平不同的细胞中 RNAi 效果的比较  51-54
  讨论  54-57
小结  57-58
参考文献  58-63
个人简历和研究成果  63-64
致谢  64

相似论文

  1. 基于蛋白质互作网络的疾病相关miRNA挖掘方法的研究,R341
  2. miRNA-23a在C2C12细胞成肌分化过程中的调节作用研究,Q952.5
  3. 农业昆虫中微RNA基因的生物信息学预测,S186
  4. 以小鼠N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶为靶点miRNA的筛选和鉴定,R346
  5. 电离辐射诱发microRNA表达改变及其对辐射损伤调控机制,R144
  6. 细胞色素b基因RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化,Q943
  7. MicroRNA表达谱和计算机分析人类子宫内膜着床窗期基因表达,R321
  8. MicroRNA在PCOS大鼠模型卵巢中的表达,R711.75
  9. MiRNA-148a→DNA甲基转移酶1→MiRNA-148a启动子甲基化在肝细胞癌发生中的意义,R735.7
  10. MiRNA机制相关蛋白在不同类型慢性鼻-鼻窦炎中的表达,R765.41
  11. 番茄Sly-miR167启动子的分离与调控分析,S641.2
  12. miR-22在舌癌细胞对平阳霉素药物敏感性中的作用及分子机制,R739.86
  13. 宫颈鳞癌转移相关miRNA表达谱的初步研究,R737.33
  14. smad4及Wnt3a对MSCs的miRNA谱的影响,R580
  15. MicroRNA-182与淋巴细胞肿瘤糖皮质激素耐药的相关性研究,R392.4
  16. miRNA多重调控模式的影响因素分析与算法研究,Q522
  17. 蚯蚓非编码小RNA的克隆与鉴定,Q78
  18. 人类miRNA调控因子及靶基因的基因本体分析,R346
  19. 序列结构二联语法识别miRNA前体,TP391.41
  20. 家蚕核型多角体病毒编码的miRNA及其功能初步研究,S884.51
  21. LMP-1对人鼻咽癌细胞株CNE1 miRNA表达谱的影响,R739.63

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
© 2012 www.xueweilunwen.com