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不同组合益生菌对鲫鱼生长性能、免疫功能及肠道菌群结构影响研究

作　者: 张强
导　师: 曾东；倪学勤
学　校: 四川农业大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 益生菌 鲫鱼 免疫功能 肠道菌群 DGGE
分类号: S963.73
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


在水产养殖中益生菌被重新定义为通过改善宿主和周围环境的微生物菌群提高饵料利用率、宿主免疫力、改善周围水质环境、对宿主产生有益影响的活的微生物。益生菌通过加强肠道微生物区系的屏障作用或通过增进非特异性免疫功能,维持宿主微生态平衡,提高其水产动物健康水平。水产养殖中有关益生菌的研究最初集中在幼鱼,目前多集中在鱼、虾、贝、甲壳类、活饵料生物等。本试验以鲫鱼为研究对象,在基础日粮中添加不同组合益生菌探讨对鲫鱼生长性能、免疫功能、肠道菌群的影响,为益生菌在水产养殖业中的应用提供指导和进一步深入研究提供理论依据。具体如下：选用初始体重为15±0.5g健康鲫鱼为试验对象,随机放入到12个玻璃水族箱(50cm×50 cm×80 cm)饲养,共计240尾,在其基础日粮中分别添加0‰益生菌(A组),1‰的枯草芽孢杆菌制剂(B组),0.5‰枯草芽孢杆菌与0.5‰光合细菌混合制剂(C组),0.5‰枯草芽孢杆菌与0.5‰乳酸菌混合制剂(D组),每组设三个重复,且每组饲料菌剂的菌数均为106 cfu/g同一浓度水平,在室内循环系统中进行为期6周的试验,分别在14d、28d、42d检测各试验组鲫鱼白细胞吞噬、杀菌活性、血清溶菌酶活力、血清SOD活力,并在0d、42d对各组鲫鱼进行称重,计算生长性能指标；在14d、28d、42d采取各组鲫鱼肠道内容物,通过PCR-DGGE分子技术检测鲫鱼肠道菌群的结构与多样性变化,并选取共性条带与特异性条带进行克隆测序分析。研究结果：在生长性能方面,试验B组的鲫鱼增重率、特定生长率、饵料系数、与空白A组差异显著(P<0.05),但其它各组之间差异不明显(P>0.05),试验证明；在饲料中添加益生菌能促进鲫鱼的生长,且单一的枯草芽孢杆菌较好。在免疫指标方面,试验B组鲫鱼的白细胞吞噬、杀菌活性、血清溶菌酶活力、血清SOD活力在各阶段与对照组A差异显著(P<0.05),且在28天时,白细胞吞噬、血清SOD与对照组A差异极显著(P<0.01)；试验C组在28d、42d时段鲫鱼的白细胞吞噬、杀菌活性、血清溶菌酶活力、血清SOD活力与对照组A差异显著(P<0.05),试验D组上述3项指标都高于对照组A,但效果没有实验B、C组好,证明不同组合益生菌能有效地提高鲤鱼的白细胞的吞噬活性、杀菌活性和血清溶菌酶活力,且试验B组效果优于其它试验组。在肠道菌群方面,试验B组鲫鱼肠道菌群的相似性系数为85%-91%、88%-93%、92%-100%高于空白对照组A(58%-73%、69%-72%、73%-83%),在14d、28d、42d,B组鲫鱼多样性条带分别为21、27、24.3,均高于空白对照组的13.3、17.7、20；试验C组鲫鱼肠道菌群的相似性系数为73%-93%、92%-100%、90%-100%高于空白对照组,但较B组差,C组多样性条带分别为16.3、24、21.3均高于空白对照组；试验D组在各阶段的相似性系数与多样性条带较B、C组差,试验证明：不同组合的益生菌能有效改善鲫鱼肠道菌群的环境,且B组的效果较C、D组好。本试验分别在DGGE图谱上选择各组共性强的条带和图谱上特异性的条带进行DGGE纯化,克隆,测序,测序结果表明：共性强的条带为大肠杆菌,特异性条带为乳酸杆菌、军团杆菌以及不能培养的细菌。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
前言  11-12
第一部分 文献综述  12-25
  1 水产动物益生菌的基础研究  12-15
    1.1 益生菌的概念  12
    1.2 水产动物益生菌研究的特点  12-13
    1.3 水产动物益生菌的分类及特征  13-15
  2 益生菌作用机制的研究  15-18
    2.1 益生菌分泌物作用  15-16
    2.2 竞争抑制  16
    2.3 对水产动物的免疫系统的影响  16-17
    2.4 产生抑菌物质  17
    2.5 改善水质  17-18
    2.6 其他作用机制的研究  18
  3 益生菌在水产养殖中的研究应用现状  18-20
  4 影响微生态制剂使用效果的因素  20-21
    4.1 益生菌的活力和稳定性  20
    4.2 使用方式  20
    4.3 投服剂量  20-21
    4.4 时间  21
  5 16SRDNA的PCR-DGGE技术  21-23
    5.1 DGGE技术原理  21-22
    5.3 DGGE技术的优点  22
    5.4 DGGE在肠道菌群研究中的应用  22-23
  6 未来研究方向  23-24
    6.1 复合菌制剂  23-24
    6.2 高稳定性制剂  24
    6.3 专一制剂  24
  7 存在的问题及试验目的和意义  24-25
第二部分 不同组合益生菌对鲫鱼生长性能及免疫性能的影响研究  25-39
  1 试验材料与试验设计  25-31
    1.1 试验材料  25-27
      1.1.1 枯草芽孢杆菌制剂  25
      1.1.2 乳酸菌菌剂  25
      1.1.3 光合细菌菌剂  25
      1.1.4 吞噬菌体的制备  25
      1.1.5 试验试剂  25-27
      1.1.6 试验仪器  27
    1.2 试验设计  27-29
      1.2.1 试验日粮  28-29
      1.2.2 饲养管理  29
      1.2.3 生长性能  29
    1.3 活菌数测定  29
    1.4 免疫指标测定  29-31
      1.4.1 样品采集  29-30
      1.4.2 白细胞悬液制备  30
      1.4.3 血清溶菌酶活力测定  30
      1.4.4 血清SOD活力测定  30
      1.4.5 白细胞吞噬活性测定  30
      1.4.6 白细胞杀菌活性测定  30-31
  2 数据处理  31
  3 结果与分析  31-34
    3.1 生长性能  31
    3.2 免疫指标  31-34
      3.2.1 血清溶菌活力  31-32
      3.2.2 血清SOD活力  32-33
      3.2.3 血液白细胞吞噬活性  33-34
      3.2.4 血液白细胞杀菌活性  34
  4 讨论  34-38
    4.1 芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌对水生动物生长性能及免疫功能的影响  34-35
    4.2 生长性能的影响  35-36
    4.3 血清溶菌酶活力的影响  36
    4.4 血清SOD活力的影响  36-37
    4.5 鲫鱼血液白细胞吞噬和杀菌活性的影响  37-38
  5 结论  38-39
第三部分 不同组合益生菌对鲫鱼肠道菌群结构多样性影响研究  39-58
  1 试验材料与试验设计  39
  2 肠道菌群测定  39-44
    2.1 样品采集  39
    2.2 肠道菌群总DNA的提取  39-40
    2.3 细菌16S rDNA V3区PCR扩增  40
    2.4 细菌基因组总DNA 16S rDNA V3区扩增片段DGGE分析  40-42
      2.4.1 仪器预处理  40
      2.4.2 所需溶液配置  40-41
      2.4.3 DGGE电泳胶的灌制  41
      2.4.5 电泳  41
      2.4.6 染色  41-42
    2.5 回收条带16S rDNA V3区的PCR扩增  42
    2.6 克隆  42-44
      2.6.1 感受态细胞的制备  42-43
      2.6.2 连接  43
      2.6.3 转化  43-44
      2.6.4 检测  44
        2.6.4.1 蓝白斑筛选  44
        2.6.4.2 菌落PCR  44
        2.6.4.3 阳性克隆子测序  44
  3 数据处理  44
  4 结果与分析  44-54
    4.1 肠道内容物细菌总DNA提取结果  44-45
    4.2 细菌16S rDNA V3区PCR扩增结果  45-46
    4.3 试验第14d各组鲫鱼肠道菌群结构多样性分析  46-48
    4.4 试验第28d各组鲫鱼肠道菌群结构多样性分析  48-50
    4.5 试验第42d各组鲫鱼肠道菌群结构多样性结果与分析  50-52
    4.6 DGGE回收条带纯化结果  52
    4.7 克隆后检测  52-53
    4.8 测序结果  53-54
  5 讨论  54-57
    5.1 芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌对水产动物肠道菌群的影响  54-55
    5.2 枯草芽孢杆菌组对鲫鱼肠道菌群的影响  55-56
    5.3 枯草芽孢杆菌和光合细菌组对鲫鱼肠道菌群的影响  56
    5.4 枯草芽孢杆菌、乳酸菌组对鲫鱼肠道菌群的影响  56
    5.5 益生菌对DGGE共性条带与特异性条带的影响  56-57
    5.6 PCR-DGGE对肠道菌群研究的局限性  57
  6 结论  57-58
参考文献  58-65
致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 水产动物饵料及其营养 > 配合饲料 > 饵料添加剂
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