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黄鳝肠道菌群的初步分析和益生菌的开发与应用研究

作　者: 贺中华
导　师: 陈昌福
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 黄鳝 肠道菌群 枯草芽抱杆菌 筛选 鉴定
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究在对健康和患细菌性败血症黄鳝肠道菌群进行初步分析的基础上,通过对分离自健康黄鳝肠道的118株菌株进行产酶能力测定,并结合点种法病原菌拮抗实验和药敏实验结果,得到拟选菌株HY-136,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);接着对该菌的耐高温、耐酸性、安全性、培养条件及培养基成分的优化进行了研究,并且将其添加到饲料中探讨了该菌对黄鳝生长和非特异性免疫机能的影响。具体研究结果如下：1、健康黄鳝肠道菌群特点为：前肠细菌数量为1.54×106cfu/g,后肠细菌数量为5.65×107cfu/g。肠杆菌科和气单胞菌属分别占健康黄鳝肠道菌群总数的37.29%、17.80%,是健康黄鳝肠道的主要菌群。同时,还分离到不动杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属和黄杆菌属的部分菌落。此外,健康黄鳝肠道前肠检测出9类细菌,而后肠肠段中只有5类。而患细菌性败血症的黄鳝肠道菌群特点为：前肠细菌数量为9.83×105cfu/g,后肠细菌数量为8.78×105cfu/g。肠杆菌科和气单胞菌属在患病黄鳝肠道细菌数量中也占有较大比例,分别达到22.50%和38.33%,前、后肠分别只检测到7类和4类细菌。经比较发现：肠杆菌科和气单胞菌属是黄鳝肠道的优势菌群,黄鳝肠道菌群中前肠细菌的种类多于后肠,患细菌性败血症的黄鳝肠道细菌总数少于健康黄鳝,机体处于不同状态下,其肠道中各类菌群所占总菌群数量的比例以及菌群种类都可能发生变化。2、对分离自健康黄鳝肠道的118株菌的产酶能力测定结果表明,能产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、明胶液化酶的菌株分别占分离菌株总数的33.03%、26.27%、50.00%、20.34%,若仅考虑产酶能力测试实验结果,菌株HY-136和菌株HY-157具有一定的开发前景。病原菌拮抗实验表明,菌株HY-136对嗜水气单胞菌,温和气单胞菌,鳗弧菌,迟钝爱德华氏菌等4株指示菌都产生了拮抗作用,菌株HY-201、HY-212也对部分指示菌有拮抗作用。药敏实验结果显示,菌株HY-201对7种抗生素产生耐药性,而菌株HY-136对绝大多数抗生素都较为敏感。综合相关实验结果,将菌株HY-136作为益生菌株进行分类鉴定。通过对该菌株进行形态观察,常规生理生化鉴定和应用API 50 CHB鉴定盒鉴定,并利用PCR技术对该菌株16S rRNA序列作测定与分析,确定菌株HY-136为Bacillus subtilis。3、耐性及安全性实验表明：菌株HY-136对高温,低pH值环境均具备较好的耐受性；急性毒性实验中,HY-136菌悬液浓度即使在1.0×109cfu/mL的水平上,幼鳝也没有发生死亡或不良的体征现象。4、菌株HY-136的最适培养条件是：培养时间为22h,初始pH值为7.0,培养温度为32℃,接种量4% (v/v),培养基最佳氮源为牛肉膏,最佳碳源为葡萄糖,最佳无机盐源为氯化钙。并通过L9(34)正交实验,确定菌株HY-136的培养基优化配方为：牛肉膏2.0% (w/v),葡萄糖2.0% (w/v),氯化钙0.5% (w/v)。5、投喂含有益生菌HY-136的各添加组与对照组相比在平均增重量方面存在显著差异,说明该益生菌株对黄鳝的生长有一定的促进作用。虽然在血清总蛋白含量指标上无显著差异,但各添加组的白细胞吞噬活性、溶菌酶活性以及超氧化物歧化酶活性等非特异性免疫指标均与对照组存在显著或极显著差异,并且用嗜水气单胞菌对各实验组黄鳝进行人工感染时,各添加组均对黄鳝产生了一定的免疫保护作用。尤其是含量为为1.0×109 cfu/g的组别,不管在增重量、各种测定的非特异性免疫指标还是相对免疫保护率,相对而言差异尤为明显,这也一定程度上说明了在黄鳝饲料中添加量为1.0×109 cfu/g时,发挥效用最大,不过,这一结果有待进一步实验验证。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章 文献综述及研究目的意义  11-20
  1.1 鱼类肠道菌群的研究概况  11-13
    1.1.1 鱼类肠道菌群的形成、数量和组成  11-12
    1.1.2 鱼类正常肠道菌群的作用方式  12-13
  1.2 水产动物益生菌的应用研究进展  13-18
    1.2.1 水产动物益生菌的作用机理  14-16
    1.2.2 益生菌在水产动物养殖过程中的应用  16-18
  1.3 本课题研究目的与意义  18-20
第2章 健康与患病黄鳝肠道菌群的初步分析  20-26
  2.1 材料与方法  20-22
    2.1.1 供试鱼  20
    2.1.2 肠道细菌的分离  20
    2.1.3 肠道细菌的计数  20-22
    2.1.4 肠道细菌的鉴定  22
  2.2 结果与分析  22-24
    2.2.1 健康与患细菌性败血症黄鳝肠道各肠段的细菌数量  22
    2.2.2 健康黄鳝肠道各肠段的菌群组成  22-23
    2.2.3 患细菌性败血症黄鳝肠道各肠段的菌群组成  23-24
  2.3 讨论  24-26
第3章 黄鳝肠道益生菌的筛选鉴定与系统发育分析  26-39
  3.1 材料与方法  26-29
    3.1.1 供试菌株  26
    3.1.2 其他实验材料  26
    3.1.3 培养基的制备  26-27
    3.1.4 各菌株产酶情况的初步筛选  27
    3.1.5 各菌株产酶能力的筛选实验  27
    3.1.6 点种法病原菌拮抗实验  27-28
    3.1.7 拟选菌株的药敏实验  28
    3.1.8 拟选菌株HY-136的形态特征和生理生化鉴定  28
    3.1.9 拟选菌株HY-136的API 50 CHB鉴定盒鉴定  28
    3.1.10 拟选菌株HY-136的16S rRNA基因序列分析  28-29
  3.2 结果与分析  29-36
    3.2.1 118株菌株产酶情况的初步筛选结果  29-31
    3.2.2 产蛋白酶菌株的产酶能力  31-32
    3.2.3 产淀粉酶菌株的产酶能力  32
    3.2.4 产脂肪酶菌株的产酶能力  32-33
    3.2.5 病原菌的拮抗效果研究  33
    3.2.6 拟选菌株的药敏实验结果  33-34
    3.2.7 菌株HY-136的形态特征和传统生理生化鉴定  34
    3.2.8 菌株HY-136的API 50 CHB鉴定结果  34-35
    3.2.9 菌株HY-136的16S rRNA基因序列分析  35-36
  3.3 讨论  36-39
第4章 益生菌HY-136的生物特性研究  39-42
  4.1 材料与方法  39-40
    4.1.1 材料  39
    4.1.2 种子液及菌悬液的制备  39
    4.1.3 菌株HY-136的耐热性研究  39
    4.1.4 菌株HY-136的耐酸性研究  39-40
    4.1.5 菌株HY-136的急性毒性实验  40
  4.2 结果与分析  40-42
    4.2.1 菌株HY-136的耐热性状况  40
    4.2.2 菌株HY-136的耐酸性状况  40-41
    4.2.3 菌株HY-136的急性毒性实验  41-42
第5章 益生菌HY-136培养条件及培养基成分的优化研究  42-48
  5.1 材料  42
  5.2 实验方法  42-43
    5.2.1 最适培养条件的确定  42-43
    5.2.2 培养基成分的选择  43
  5.3 结果与分析  43-48
    5.3.1 不同培养时间对菌株HY-136生长量的研究实验结果  43-44
    5.3.2 不同初始pH值对菌株HY-136生长量的研究实验结果  44
    5.3.3 不同温度对菌株HY-136生长量的研究实验结果  44-45
    5.3.4 不同接种量对菌株HY-136生长量的研究实验结果  45
    5.3.5 不同氮源对HY-136生长量的研究实验结果  45
    5.3.6 不同碳源对HY-136生长量的研究实验结果  45-46
    5.3.7 不同无机盐对HY-136生长量的研究实验结果  46
    5.3.8 L_9(3~4)正交实验结果  46-48
第6章 益生菌HY-136对黄鳝生长及非特异性免疫机能的影响  48-56
  6.1 材料与方法  48-50
    6.1.1 材料  48
    6.1.2 实验方法  48-49
    6.1.3 采血及血清制备  49
    6.1.4 白细胞吞噬活性的测定  49
    6.1.5 溶菌酶活性的测定  49
    6.1.6 血清中SOD活性和血清中总蛋白含量的测定  49-50
    6.1.7 攻毒  50
    6.1.8 数据处理  50
  6.2 结果与分析  50-54
    6.2.1 饲料中添加益生菌HY-136对黄鳝生长的影响  50-52
    6.2.2 对白细胞吞噬活性的影响  52
    6.2.3 对溶菌酶活性的影响  52
    6.2.4 对SOD活性和血清中总蛋白含量的影响  52-53
    6.2.5 攻毒实验结果  53-54
  6.3 讨论  54-56
参考文献  56-63
附录 硕士期间成绩一览  63-64
致谢  64

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