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靶向Notch1shRNA重组质粒的构建及其对L02/HBx细胞生物学行为的影响*

作　者: 夏秀梅
导　师: 程斌
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: 细胞性肝癌 HBx Notch1 短发夹状RNA P16 Bcl-2 核转录因子kappaB
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的前期研究初步发现HBx可激活L02细胞的Notch1信号通路并参与肝细胞的恶性转化,本研究拟通过构建靶向Notch1基因的shRNA重组质粒干扰阻断L02/HBx细胞Notch1信号通路后观察其对细胞增殖、周期及凋亡的影响,旨在探讨Notch1信号通路在HBx致L02细胞恶性转化中的作用及分子机制。方法(1)设计3对针对Notch1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染转基因细胞L02/HBx,qRT- PCR及Western Blotting分别检测瞬时转染pshRNA前后Notch1蛋白及mRNA的表达,筛选出干扰效率最强的pshRNA;(2)将筛选出的干扰效率最强的pshRNA稳定转染至L02/HBx细胞,qRT- PCR及Western Blotting检测Notch1信号通路各组分mRNA及蛋白的表达;(3) CCK-8法和流式细胞学分别检测干扰阻断Notch1信号通路前后L02/HBx细胞增殖及周期凋亡的变化;(4) qRT- PCR及Western Blotting检测干扰阻断Notch1信号通路前后L02/HBx细胞周期抑制因子P16及细胞凋亡抑制因子Bcl-2表达的变化;(5)电泳迁移率变动分析(EMSA)法检测干扰阻断Notch1信号通路前后L02/HBx细胞NF-κB的DNA结合率的变化。结果(1)成功构建含Notch1 shRNA片段的重组质粒,分别命名为pshRNA1、2、3,瞬时转染L02/HBx细胞后,Notch1基因的mRNA及蛋白表达水平均下调。其中,pshRNA1重组质粒的沉默效应最强,其RNA水平的抑制率为78.83%(p<0.05)。(2)将干扰效率最强的pshRNA1重组质粒稳定转染至L02/HBx细胞后,qRT- PCR及Western Blotting检测Notch1信号通路Notch1受体、Jagged1配体及靶基因Hes1的mRNA及蛋白表达均下调(p<0.01),其中Notch1基因RNA水平的抑制率达91.68%(p<0.01)。(3)运用pshRNA1稳定转染L02/HBx细胞干扰阻断Notch1信号通路后,CCK-8及流式细胞学检测L02/HBx-shRNA1细胞增殖、周期与凋亡状况,与对照组相比,其细胞增殖速度减慢(p<0.05),细胞周期的G0/G1期细胞比例增加(p<0.01)、S期细胞比例减少(p<0.05),细胞凋亡增加(p<0.05)。(4)运用pshRNA1稳定转染L02/HBx细胞干扰阻断Notch1信号通路后,qRT- PCR及Western Blotting检测L02/HBx-shRNA1细胞的细胞周期抑制因子P16及凋亡抑制因子Bcl-2的表达水平。与对照组相比, P16的mRNA及蛋白表达均上调(p<0.05),Bcl-2的mRNA及蛋白表达均下调(p<0.001)。(5)运用pshRNA1稳定转染L02/HBx细胞干扰阻断Notch1信号通路后,EMSA检测发现L02/HBx-shRNA1细胞的NF-κB的DNA结合率降低。结论(1)靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒构建成功,含靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒能有效阻断Notch1信号通路;(2)干扰Notch1信号通路可以抑制L02/HBx细胞的增殖,阻碍其细胞周期进程及促进凋亡,结合前期的研究结果,HBx可激活Notch1信号通路并促进L02细胞的增殖与转化,表明HBx可能通过Notch1信号通路的激活来促进L02细胞的恶性转化;(3)在干扰Notch1信号通路抑制L02/HBx细胞的增殖,阻碍其细胞周期进程及促进凋亡的过程中,可能通过上调细胞周期抑制因子P16与下调细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达而起作用;(4) Notch1信号通路可能与NF-κB信号通路之间发生串话作用,共同参与HBx致L02细胞的恶性转化与癌变发生机制。

全文目录


英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-14
第一部分 靶向 Notch1 shRNA 重组质粒的构建  14-29
  1 材料和方法  14-21
  2 结果  21-26
  3 讨论  26-29
第二部分 阻断 Notch 信号通路对 L02/HBx 细胞生物学行为 的影响及其作用机制的初步研究  29-40
  1 材料和方法  29-32
  2 结果  32-38
  3. 讨论  38-40
结论  40-41
展望  41-42
参考文献  42-46
综述 氧化应激与HBV 相关性肝癌的研究进展  46-55
  参考文献  50-55
附录1 实验中所使用的主要仪器及试剂配制  55-59
附录2  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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