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基于Ru（bpy）_3~（2+）的电致化学发光生物传感器的研制

作　者: 董平
导　师: 方禹之；何品刚
学　校: 华东师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 电致化学发光固相生物传感器核酸适配体分子灯塔凝血酶猝灭作用壳聚糖选择性固定
分类号: TP212.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

核酸适配体(aptamer)是一种能特异性地结合如小分子、蛋白质甚至是细胞等目标物的单链DNA片段。与传统的抗体相比较,aptamer在对分析物检测上具有化学稳定性高、实用性强、基团修饰简便以及在生物传感器设计上能高度适应兼容。近十年来,aptamer已经在药物诊断、新药筛选、蛋白质分析、生物传感器和分子开关研制领域成为有着广泛应用前景的识别元件。将aptamer与荧光、化学发光和毛细管电泳等检测方法联用可分别实现对原癌蛋白血小板源性生长因子、可卡因和IgE等多种物质的灵敏检测。将aptamer与各种分析技术联用来实现对特定序列DNA、蛋白、酶及生物活性小分子的检测将对功能基因组、蛋白质组、癌症诊断研究起到至关重要的作用。电致化学发光(ECL)是在化学发光的基础上发展起来的一种新的分析方法,它是化学发光与电化学互相渗透的产物,这种方法不但可以利用电化学分析的特长,而且可以发挥化学发光分析的优点,具有高灵敏度、高选择性、操作快速简便和仪器简单等特点,已成为分析领域,尤其是生物分析领域工作者感兴趣的重要课题。Ru(bpy)32+作为电致化学发光试剂,已经广泛被应用于传统液相ECL体系中,但由于其价格昂贵,故而如何成功有效地将其固定到电极上制成固相电致化学发光传感器以减少试剂消耗就显得尤为重要。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰基过程制备的一种富含氨基的多聚糖,在自然界中含量十分丰富。由于壳聚糖具有良好的生物相溶性、生物可降解性,可成膜性及高效的生物活性等特点,现已广泛应用到医药、化工、饲料、农业、环保和生物技术等各个领域。近年来,壳聚糖作为一种优良的膜材料,也越来越受到人们的重视。当壳聚糖溶液的pH值小于6.3时呈现可溶状态,当pH值大于6.3时,此时壳聚糖形成凝胶状,故而可通过对pH值的调控将壳聚糖膜制成特殊的固定化载体。本论文将生物分子识别元件与电致化学发光技术的高灵敏度特性相结合,构建具有高选择性的新型固相电致化学发光生物传感器,实现对凝血酶的检测。此外,还利用壳聚糖膜的特征,将Ru(bpy)32+选择性地电沉积到电极上,开发了一种全新的Ru(bpy)32+高效固定方法。本论文主要内容如下：第一章绪论本章简要介绍了电致化学发光(ECL)分析方法的概念、原理和特点,以及各种ECL反应类型及其在分析化学中的应用,展望了ECL分析的未来发展前景。介绍了DNA与核酸适配体生物传感器的构造原理、分类特点和分析应用。介绍了壳聚糖的理化特性、壳聚糖膜的优势及其在生物技术方面的应用。最后阐述了本论文的目的和意义,指出论文的创新之处。第二章基于二茂铁标记分子灯塔适配体的固相ECL传感器实现对凝血酶的检测本章利用标记有二茂铁(Fc)的核酸适配体,结合分子灯塔特殊茎环结构,构建了全新的固相电致化学发光(ECL)生物传感器,并对凝血酶成功实现检测。这种特殊结构的生物传感器包含了ECL发光基底以及ECL信号开关两部分。金胶钌混聚物(Ru(bpy)32+-AuNPs)通过Au-S键固定到金电极上构成ECL发光基底,而标记有二茂铁的分子灯塔适配体则作为ECL信号开关,其环部由能够与凝血酶发生特异性结合的一段特殊序列构成。当凝血酶与核酸适配体发生反应时,分子灯塔的茎部打开,此时标记在一端的Fc远离发光基底,Fc对Ru(bpy)32+的猝灭作用降低,从而使得ECL信号增强。第三章基于无标记适配体和分子灯塔构型变换的固相ECL传感器实现对凝血酶的检测本章报道了一种利用非标记适配体与凝血酶之间的特异性结合作用以及分子灯塔的构象变化,通过检测前后的ECL信号变化来定量反映目标蛋白——凝血酶的含量。将与凝血酶适配aptamer杂交的标记有二茂铁(Fc)的分子灯塔(Fc-dsDNA)固定到ECL发光层上,当aptamer与凝血酶反应后,单链分子灯塔回环,二茂铁端接近发光层,ECL信号猝灭。利用前后两次ECL信号变化对凝血酶的浓度进行定量测定。此传感器具有高灵敏度和高选择性。第四章阵列电极上选择性固定Ru(bpy)32+的固相电致化学发光传感器构建本章基于将包裹三-(2,2’-联吡啶)钌(II)(Ru(bpy)32+)的硅纳米颗粒(RuDS NPs)/壳聚糖复合膜电沉积到电极表面这一原理,开发了一种有效将Ru(bpy)32+选择性固定在目标电极上的方法,即将Ru(bpy)32+选择性固定到阵列电极的任意电极上。实验结果不仅证明了能有效将Ru(bpy)32+选择性固定到阵列电极上的可能性,而且能多通道选择性固定不同的复合膜。故而此方法在生物分析、毛细管电泳和药物筛选上都有很重要的应用前景。实验采用紫外可见光谱、场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)和透射电子显微镜(TEM)来表征RuDS NPs以及复合膜。基于复合膜修饰电极的电致化学发光传感器对三丙胺(TPrA)的检测呈现良好的重现性、稳定性和灵敏度。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-14
第一章绪论  14-38
  1 电致化学发光及其在分析化学中的应用  14-20
    1.1 电致化学发光的特点  14-15
    1.2 电致化学发光反应的反应类型  15-19
    1.3 电致化学发光分析发展前景  19-20
  2 DNA生物传感器和核酸适配体生物传感器的介绍  20-28
    2.1 DNA的基本知识  20-21
    2.2 DNA生物传感器  21-23
    2.3 核酸适配体生物传感器  23-28
    2.4 寡聚核苷酸链ssDNA的固定  28
  3 壳聚糖的研究进展  28-31
    3.1 壳聚糖的理化性质  29-30
    3.2 壳聚糖膜的优势  30-31
    3.3 壳聚糖在生物技术方面的应用  31
  4 本论文的目的和意义  31-33
  参考文献  33-38
第二章基于二茂铁标记分子灯塔适配体的固相ECL传感器实现对凝血酶的检测  38-52
  摘要  38
  1 引言  38-40
  2 试剂与仪器  40-43
    2.1 仪器  40
    2.2 试剂  40-41
    2.3 Fc-MBA-Ru(bpy)_3~(2+)-AuNPs电极的制备  41-43
    2.4 Fc-MBA与凝血酶结合  43
    2.5 ECL检测  43
  3 结果与讨论  43-49
    3.1 AuNPs和Ru(bpy)_3~(2+)-AuNPs的表征  43-44
    3.2 修饰电极的表征  44-46
    3.3 对凝血酶溶液的检测  46-47
    3.4 凝血酶与适配体培育时间的优化  47-48
    3.5 凝血酶检测的选择性  48
    3.6 凝血酶的定量检测  48-49
  4 结论  49-50
  参考文献  50-52
第三章基于无标记适配体和分子灯塔构型变换的固相ECL传感器实现对凝血酶的检测  52-64
  摘要  52
  1 引言  52-54
  2 试剂与仪器  54-56
    2.1 仪器  54
    2.2 试剂  54
    2.3 Fc-dsDNA-Ru(bpy)_3~(2+)-AuNPs电极的制备  54-56
    2.4 Fc-dsDNA与凝血酶结合  56
    2.5 ECL检测  56
  3 结果与讨论  56-61
    3.1 FC-MB的表征  56-57
    3.2 Fc-dsDNA-Ru(bpy)_3~(2+)-AuNPs电极的表征  57-58
    3.3 ECL生物传感器对凝血酶的识别  58-59
    3.4 凝血酶的定量检测  59-60
    3.5 凝血酶检测的选择性  60-61
  4 结论  61-62
  参考文献  62-64
第四章阵列电极上选择性固定Ru(bpy)_3~(2+)的固相电致化学发光传感器构建  64-74
  摘要  64
  1 引言  64-65
  2 仪器和试剂  65-67
    2.1 试剂  65
    2.2 仪器  65-66
    2.3 金阵列电极的制备  66-67
    2.4 RuDS NPs的制备  67
    2.5 RuDS NPs/壳聚糖复合膜在金阵列电极表面的电沉积  67
  3 结果与讨论  67-72
    3.1 二氧化硅包裹联吡啶钌纳米粒子(RuDS NPs)和壳聚糖复合膜的表征  67-68
    3.2 RuDS NPs/壳聚糖膜的电沉积方法研究  68-69
    3.3 RuDS NPs/壳聚糖膜修饰电极的电化学和ECL表征  69-70
    3.4 传感器性能  70-71
    3.5 Ru(bpy)_3~(2+)在金阵列电极上的选择性固定  71-72
  4 结论  72-73
  参考文献  73-74
附录:硕士在读期间科研成果  74-75
致谢  75-76

基于Ru（bpy）_3~（2+）的电致化学发光生物传感器的研制

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