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薯蓣皂苷对牛胸主动脉内皮细胞的保护作用及其机理的研究

作　者: 谭培艺
导　师: 高卫真；康毅
学　校: 天津医科大学
专　业: 药理学
关键词: 薯蓣皂苷内皮细胞 MDA LDH NO SOD eNOS Ca2+
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的研究薯蓣皂苷(Dioscin, Dio)对培养牛胸主动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells, BAECs)高糖损伤(high glucose damage, HG damage)的保护作用,并探讨其作用机制。方法1.采用机械刮取法体外培养牛胸主动脉内皮细胞,绘制细胞生长曲线,利用Ⅷ因子相关抗原,采用免疫组化法进行内皮细胞鉴定。2.建立高糖损伤内皮细胞模型,以薯蓣皂苷进行干预。内皮细胞随机分为5组：空白对照组(Control, C);高糖损伤组(High glucose, HG)终浓度120mmol/L;薯蓣皂苷低、中、高剂量干预组(Dio L、M、H+ HG)终浓度分别为2、6、10μg/ml。3.分别观察各组血管内皮细胞形态学变化；MTT法测定内皮细胞存活率；硝酸还原酶法测定内皮细胞NO浓度；硫代巴比妥酸法(TBA法)测定内皮细胞MDA含量；黄嘌呤氧化酶法测定内皮细胞SOD活力；苯肼法测定内皮细胞LDH漏出；荧光指示剂测定法检测细胞内游离钙浓度[Ca2+]i; Western Blot测定内皮细胞eNOS的蛋白表达。结果1.机械刮取法培养原代牛胸主动脉内皮细胞：细胞呈多角形,核仁显著,呈圆形或椭圆形。在接种24h后贴壁生长,2-3d有细胞从组织块钻出,10d左右细胞融合成单层,如“铺路石”样镶嵌排列。Ⅷ因子相关抗原免疫组化法检测,胞浆内可见黄绿色颗粒,证明培养的细胞为内皮细胞。2.细胞形态学变化：与空白对照组比较,高糖损伤组内皮细胞肿胀、圆缩,胞体变小,细胞间隙增宽,边界模糊；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组细胞形态明显饱满,圆缩细胞减少,细胞间连接增加,边界变得清楚。3.内皮细胞存活率：薯蓣皂苷各剂量组单独作用于血管内皮细胞,细胞存活率无显著性变化；与空白对照组比较,高糖损伤组血管内皮细胞存活率显著降低(69.041±3.5021vs. 92.202±7.1534,P<0.05)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞存活率显著升高(0.684±0.0301vs.0.567±0.0414,0.692±0.0495vs.0.567±0.0414,0.692±0.0495vs.0.567±0.0414,P<0.05)。4.内皮细胞NO浓度：硝酸还原酶法测定细胞NO浓度,与空白对照组比较,高糖损伤组血管内皮细胞NO浓度显著降低(69.041±3.5021vs.92.202±7.1534,P<0.05)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞NO浓度显著升高(103.302±8.5809vs.69.041±3.5021,104.777±9.3255vs.69.041±3.5021,104.342±4.4529vs.69.041±3.5021,P<0.05)。5.内皮细胞SOD活力：黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,与空白对照组比较,高糖损伤组血管内皮细胞SOD活力显著降低(21.663±1.830vs.26.456±1.446,P<0.05)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞SOD活力显著提高(23.853±1.165vs.21.663±1.830,24.011±1.762vs.21.663±1.830,23.577±1.662vs.21.663±1.830,P<0.05)。6.内皮细胞MDA含量：硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量,与空白对照组比较,高糖损伤组血管内皮细胞M D A含量显著升高(0.5344±0.0661vs.0.3183±0.0418,P<0.05)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞MDA含量显著降低(0.3973±0.0082vs.0.5344±0.0661,0.3811±0.0397vs.0.5344±0.0661,0.38744±0.0128vs.0.5344±0.0661,P<0.05)。7.内皮细胞LDH漏出：苯肼法测定内皮细胞LDH漏出,与空白对照组比较,高糖损伤组内皮细胞LDH漏出显著升高(1118.702±79.4289vs.760.1744±83.2633,P<0.05)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞LDH漏出显著降低(849.322±63.227vs.1118.702±79.4289,907.838±75.662vs.1118.7024±79.4289,801.0344±90.8995vs.1118.7024±79.4289,P<0.05)。8.内皮细胞游离钙浓度[Ca2+]i：荧光指示剂测定法测定细胞内游离钙浓度[Ca2+]i,与空白对照组比较,高糖损伤组血管内皮细胞游离钙浓度[Ca2+]i显著升高(477.16±10.10vs.137.96±9.68)；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组血管内皮细胞游离钙浓度[Ca2+]i显著降低(213.68±8.76vs.477.16±10.10，220.38±11.76vs.477.16±10.10,234.78±8.77vs.477.16±10.10)。9.内皮细胞eNOS蛋白表达：Western blot测定血管内皮细胞eNOS蛋白表达。与空白对照组比较,高糖损伤组eNOS蛋白表达显著降低；与高糖损伤组比较,薯蓣皂苷各剂量干预组eNOS蛋白表达显著增加。结论细胞水平证实,薯蓣皂苷对高糖损伤的培养牛胸主动脉内皮细胞有显著的保护作用,保护机制可能涉及以下几方面：1.通过增加SOD含量,提高细胞清除氧自由基的能力,恢复自身氧化与抗氧化的平衡。2.能够显著减少由过氧化损伤产生的脂质过氧化物MDA的含量,降低氧自由基对内皮细胞的损伤程度。3.内皮细胞LDH漏出降低,细胞膜通透性降低,细胞功能得到恢复。4.通过降低细胞内钙超载,增高eNOS蛋白表达,NO合成释放增多,舒血管作用增强。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
缩略语  13-15
前言  15-18
  研究现状、成果  15-16
  研究目的、方法  16-18
一、牛胸主动脉内皮细胞的分离与原代培养  18-25
  1.1 对象和方法  18-20
    1.1.1 实验材料  18
    1.1.2 实验仪器  18
    1.1.3 药品与试剂  18
    1.1.4 实验方法  18-20
  1.2 结果  20-22
    1.2.1 BAECs的形态学观察  20-22
    1.2.2 Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定  22
  1.3 讨论  22-24
  1.4 小结  24-25
二、薯蓣皂苷对BAECs存活率及细胞形态的影响  25-32
  2.1 材料与方法  25-26
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 实验仪器  25
    2.1.3 实验试剂  25
    2.1.4 实验原理及方法  25-26
  2.2 结果  26-29
    2.2.1 薯蓣皂苷对BAECs存活率的影响  26-27
    2.2.2 薯蓣皂苷对高糖损伤的BAECs的保护作用  27-29
  2.3 讨论  29-31
  2.4 小结  31-32
三、薯蓣皂苷对高糖损伤BAECs的保护作用  32-42
  3.1 材料与方法  32-34
    3.1.1 实验材料  32
    3.1.2 实验仪器  32
    3.1.3 实验试剂  32
    3.1.4 实验原理与方法  32-34
  3.2 结果  34-38
    3.2.1 薯蓣皂苷对高糖损伤BAECs NO含量的影响  34-35
    3.2.2 薯蓣皂苷对高糖损伤BAECs内SOD活力的影响  35-36
    3.2.3 薯蓣皂苷对高糖损伤BAECs MDA含量的影响  36-37
    3.2.4 薯蓣皂苷对高糖损伤BAECs LDH漏出的影响  37-38
  3.3 讨论  38-41
  3.4 小结  41-42
四、薯蓣皂苷舒血管保护作用机制的研究  42-53
  4.1 材料与方法  42-47
    4.1.1 实验材料  42
    4.1.2 实验仪器  42
    4.1.3 实验试剂  42-43
    4.1.4 原理与方法  43-47
  4.2 结果  47-48
    4.2.1 游离钙浓度[Ca~(2+)]i测定实验结果  47-48
    4.2.2 Western blot测定eNOS蛋白表达实验结果  48
  4.3 讨论  48-52
    4.3.1 薯蓣皂苷对细胞内钙超载的作用  48-50
    4.3.2 薯蓣皂苷对高糖损伤eNOS蛋白表达的作用  50-52
  4.4 小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-58
发表论文和参加科研情况说明  58-59
综述  59-76
  血管内皮细胞功能损伤与高血压和动脉粥样硬化相关性研究进展  59-71
  综述参考文献  71-76
致谢  76-77

薯蓣皂苷对牛胸主动脉内皮细胞的保护作用及其机理的研究

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