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新型支架固定米根霉发酵L-乳酸的研究

作　者: 王润光
导　师: 王远亮
学　校: 重庆大学
专　业: 药学
关键词: 米根霉 L-乳酸葡萄糖玉米淀粉纤维素固定化发酵
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乳酸是一种重要的有机酸,在医药、食品、化工等领域应用广泛,作为原料,可以合成生物降解材料聚乳酸(PLA),PLA应用于药物,组织工程,医院等领域,同时,可望代替传统塑料,从根本上解决“白色污染”问题。与传统游离发酵相比,采用固定化米根霉发酵生产L-乳酸,可大大缩短发酵周期,解决菌丝结团问题,且固定化细胞重复稳定性好。本文采用的一种新型支架,由不锈钢细网和棉布组成,其空间网状结构对米根霉有很好的固定化作用。本文分别以葡萄糖,玉米淀粉,纤维素为碳源,检验支架的固定化发酵效果。首先,以葡萄糖为原料进行发酵。种子培养阶段:葡萄糖初始浓度为50.00 g/L,酵母浓度为2.50 g/L.在培养24h后,菌体浓度达到6.80 g/L。发酵阶段:葡萄糖初始浓度为80.00 g/L,在温度为33℃,摇床转速为180 rpm,装液量为20%,支架数为3个,时间为48h,发酵过程中及时补加CaCO3的条件下,L-乳酸平均浓度可达50.00 g/L,,转化率接近65.0%,平均产率为1.2g/ (L·h)。与游离发酵相比,固定化发酵乳酸浓度,转化率,产率分别提高了79%,250%和150%,发酵周期提前了24h,且能重复发酵7个批次.在补料发酵中,140h后,获得的乳酸累计浓度为87.30g/L。其次,以玉米淀粉为原料进行发酵。玉米淀粉在经过双酶法水解后用于发酵过程。发酵阶段:玉米淀粉浓度120g/L,尿素浓度2g/L,在支架数量3个,发酵温度33℃,摇床转速190rpm,装液量20%,发酵过程中及时补加CaCO3的条件下下,经60h发酵后乳酸浓度可达82.51g/L,对糖转化率可达68.7%,平均产率为1.4 g/ (L·h),生物量浓度保持在8.20g/L以上。与游离发酵相比,L-乳酸产量,产率,转化率比游离发酵分别提高了76%,111%和76 %。在重复批次发酵中有很好的稳定性。经过180h补料发酵后,乳酸累计浓度可达94.60g/L。然后,以纤维素为原料进行同步糖化发酵。前期纤维素酶水解:选择250mL三角瓶反应体系,加入48.8mL柠檬酸缓冲液和2g预处理后秸秆,再加入无机盐:KH2PO4 0.3g/L,MgSO4 .7H2O 0.25g/L,ZnSO4 .7H2O 0.08g/L,121℃灭菌20min后,加入1.2mL纤维素酶于50℃酶解24h;同步糖化发酵:把用2个支架固定好的米根霉菌体转入上边的发酵液中, 35℃,200rpm,固液比为0.04条件下发酵120h,发酵液pH值通过加入灭菌后的碳酸钙控制。最终,L-乳酸产量为16.00g/L,转化率可达40.0%,平均产率为0.1 g/ (L·h)。最后,以支架为固定化载体进行了鼓泡式生物反应器发酵实验,在种子培养6h后,液体培养基中的孢子全部吸附到支架上。采用单因素法,确定了鼓泡式生物反应器最佳发酵条件:通气量为0.5vvm,温度为32℃,反应4h时再加入CaCO3。连续进行了9批次重复发酵实验,获得的平均乳酸浓度为54.86g/L,平均转化率为80%,平均产率为0.57 g/L.h。与游离发酵相比,支架固定化发酵乳酸浓度提高了78%,转化率提高了78.2%。参与乳酸发酵时间延长了36h。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
1 绪论  11-19
  1.1 问题的提出及研究意义  11-12
    1.1.1 问题的提出  11-12
    1.1.2 研究意义  12
  1.2 国内外研究现状  12-18
    1.2.1 乳酸发酵用米根霉的研究  12-14
    1.2.2 米根霉发酵用原料的研究进展  14-16
    1.2.3 固定化发酵的研究进展  16-17
    1.2.4 发酵方式的研究  17-18
  1.3 本课题研究的目的及主要内容  18
    1.3.1 研究目的  18
    1.3.2 本课题研究的主要内容  18
  1.4 创新点  18-19
2 试验材料与方法  19-25
  2.1 实验原料  19
  2.2 实验试剂  19
  2.3 主要仪器设备  19-20
  2.4 固定化支架制备  20
  2.5 分析方法  20-25
    2.5.1 乳酸和葡萄糖的测定  20
    2.5.2 菌种量测定  20-21
    2.5.3 pH 值测定  21
    2.5.4 残糖的测定—DNS(3.5－二硝基水杨酸)比色法  21-22
    2.5.5 孢子浓度计数  22
    2.5.6 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配制  22-23
    2.5.7 秸秆中纤维素、半纤维素和木质素含量的测定  23-25
3 以葡萄糖为底物进行米根霉固定化发酵生产 L-乳酸  25-41
  3.1 引言  25
  3.2 培养基  25
  3.3 游离化种子培养及发酵  25
  3.4 支架固定化种子培养及发酵  25-26
  3.5 结果分析  26-36
    3.5.1 种子培养阶段  26-28
    3.5.2 发酵阶段  28-36
  3.6 讨论  36-39
    3.6.1 种子培养阶段  36
    3.6.2 发酵阶段  36-39
  3.7 小结  39-41
4 以淀粉为底物进行米根霉固定化发酵生产 L-乳酸  41-53
  4.1 引言  41
  4.2 培养基与培养方法  41-42
    4.2.1 培养基  41
    4.2.2 米根霉培养方法  41-42
  4.3 结果分析  42-49
    4.3.1 玉米淀粉浓度对发酵产酸的影响  42
    4.3.2 不同氮源对发酵产L-乳酸的影响  42-43
    4.3.3 不同尿素浓度对发酵产L-乳酸的影响  43-44
    4.3.4 发酵过程中支架数量的影响  44-45
    4.3.5 发酵温度的影响  45
    4.3.6 发酵过程中摇床转速的影响  45-46
    4.3.7 装液量对产酸的影响  46-47
    4.3.8 支架固定米根霉发酵L-乳酸稳定性的研究  47-48
    4.3.9 固定与游离发酵的比较  48
    4.3.10 补料发酵  48-49
  4.4 讨论  49-51
  4.5 小结  51-53
5 以纤维素为底物进行米根霉同步糖化发酵生产 L-乳酸  53-61
  5.1 前言  53
  5.2 实验原料  53-54
  5.3 实验方法  54
    5.3.1 汽爆后秸秆的处理  54
    5.3.2 还原糖含量的测定  54
    5.3.3 同步糖化发酵  54
  5.4 结果分析  54-58
    5.4.1 纤维素酶单独水解时间对L-乳酸生产的影响  54-55
    5.4.2 同步发酵时间对L-乳酸生产的影响  55-56
    5.4.3 支架个数对L-乳酸生产的影响  56
    5.4.4 温度对L-乳酸生产的影响  56-57
    5.4.5 转速对L-乳酸生产的影响  57-58
    5.4.6 固液比对L-乳酸生产的影响  58
  5.5 讨论  58-60
  5.6 小结  60-61
6 鼓泡式生物反应器中支架固定化发酵的研究  61-71
  6.1 前言  61
  6.2 培养基  61
  6.3 鼓泡式生物反应器中固定化种子培养及发酵  61-62
  6.4 结果分析  62-66
    6.4.1 孢子吸附情况  62-63
    6.4.2 通气量对发酵产酸的影响  63-64
    6.4.3 CaCO_3 添加时间对发酵产酸的影响  64
    6.4.4 温度对发酵效果的影响  64-65
    6.4.5 鼓泡式生物反应器重复批次发酵实验研究  65-66
    6.4.6 固定化发酵与游离发酵的比较  66
  6.5 讨论  66-69
    6.5.1 种子培养阶段孢子萌发和菌体吸附情况  66-67
    6.5.2 通气量对发酵产酸的影响  67
    6.5.3 CaCO_3 添加时间对发酵的影响  67-68
    6.5.4 温度对发酵的影响  68
    6.5.5 鼓泡式生物反应器稳定性发酵研究  68
    6.5.6 固定化发酵与游离发酵的比较  68-69
  6.6 小结  69-71
7 结论与展望  71-73
  7.1 结论  71-72
  7.2 对后续工作的展望  72-73
致谢  73-75
参考文献  75-81
附录  81

新型支架固定米根霉发酵L-乳酸的研究

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