学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

南方根结线虫部分FLP神经肽受体基因的克隆和初步功能分析

作　者: 罗亚丹
导　师: 肖启明；谢丙炎
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 南方根结线虫(Meloidogyne incognita Chitwood) 神经肽(npr) G蛋白偶联受体(GPCRs) RNA干扰(RNAi) 实时荧光定量PCR(QT-PCR)
分类号: S432.45
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 76次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

神经肽受体(neuropeptide receptor, npr)是G蛋白偶联受体(GPCRs)中的一类,能接收多种神经肽信号并传达到胞内,其中包括FLPs (FMRFamide-like peptides)。本实验主要研究两个南方根结线虫(Meloidogyne incognita Chitwood)神经肽受体基因：M.i-npr-1和M.i-npr-3基因(简称npr-1/3),主要工作如下：1.根据生物信息学预测靶标基因的序列,结合RACE法从南方根结线虫体内克隆了两个目的基因cDNA全长序列。npr-1基因开放阅读框全长1254bp,GenBank登录号为FJ456886。npr-3基因开放阅读框全长1035bp,GenBank登录号为GQ497771。生物信息分析表明,两个目的基因都具有7个跨膜结构,这是G蛋白偶联受体的典型特征。2.对npr-1和npr-3基因尝试了原核表达和真核表达,将目的基因成功地克隆到表达载体pET-30a和pPIC9K多克隆区域上。在原核和真核的诱导表达中,SDS-PAGE电泳均没有检测到目的条带。3.以南方根结线虫卵、二龄幼虫、成虫为材料,对npr-1和npr-3在不同虫态中的表达进行了分析。结果显示,两个基因在南方根结线虫卵、二龄幼虫、成虫中都有表达,说明两个目的基因在可能南方根结线虫的生活史中起重要作用。4.体外合成npr-1基因的两段dsRNA,利用浸泡法处理南方根结线虫的2龄幼虫然后侵染番茄,进行离体干扰效应验证。实验发现番茄根部的根结数量与对照相比明显下降。实时荧光定量PCR分析表明靶标mRNA表达量明显降低。上述研究结果表明npr-1基因在线虫的发育与寄生中具有关键作用。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
第一章文献综述  9-21
  1 南方根结线虫及其危害  9
    1.1 南方根结线虫的分类地位  9
    1.2 南方根结线虫的危害及防治  9
  2 线虫类FMRF酰胺肽及其G蛋白偶联受体的研究进展  9-12
    2.1 FMRF酰胺肽  9-10
    2.2 线虫FLP的GPCR  10-12
    2.3 线虫FLP-GPCR在药剂研发方面的作用  12
  3 植物抗线虫基因工程研究进展  12-20
    3.1 抗线虫基因介导的植物抗线虫基因工程  12-16
    3.2 外源蛋白  16-18
    3.3 植物寄生线虫RNAi研究进展  18-20
  4 科学问题的提出  20-21
第二章 M.I-NPR-1和M.I-NPR-3基因克隆及生物信息学分析  21-34
  1 试验方法  21-24
    1.1 植物材料培养  21
    1.2 南方根结线虫接种  21
    1.3 南方根结线虫二龄幼虫的收集  21
    1.4 南方根结线虫总RNA的提取  21
    1.5 cDNA的合成  21
    1.6 npr-1和npr-3基因片段的克隆  21-22
    1.7 RACE法扩增npr-3 3’端序列  22
    1.8 PCR扩增npr-3基因完全开放阅读框序列  22-23
    1.9 npr-1和npr-3基因内含子的扩增  23-24
  2 结果与分析  24-32
    2.1 RNA的提取  24
    2.2 npr-1及npr-3基因的扩增  24-25
    2.3 RACE结果与分析  25
    2.4 npr-3开放阅读框(ORF)序列的扩增  25
    2.5 南方根结线虫npr-1和npr-3基因的编码区序列  25-28
    2.6 目的基因内含子的扩增结果与分析  28-30
    2.7 npr-1和npr-3基因编码的蛋白的结构分析  30-32
  3 讨论  32-34
第三章 NPR-1和NPR-3基因的异源表达  34-42
  1 试验材料  34
    1.1 生物材料  34
    1.2 主要试剂、载体  34
    1.3 溶液配制  34
    1.4 培养基  34
  2 试验方法  34-39
    2.1 南方根结线虫各虫态的收集  34
    2.2 npr-1和npr-3基因的原核表达  34-36
    2.3 npr-1和npr-3基因的真核表达  36-38
    2.4 目的基因在南方根结线虫不同虫态中的表达分析  38-39
  3 结果与分析  39-40
    3.1 npr-1和npr-3基因的原核表达结果分析  39
    3.2 npr-1和npr-3基因的真核表达结果分析  39
    3.3 npr-1和npr-3基因不同虫态的表达情况  39-40
  4 讨论  40-42
第四章南方根结线虫NPR-1基因的RNAI效应分析  42-50
  1 材料与方法  42-45
    1.1 供试材料  42
    1.2 主要仪器和试剂  42
    1.3 npr-1基因dsRNA的合成  42-44
    1.4 南方根结线虫的RNAi实验  44-45
  2 结果与分析  45-49
    2.1 dsRNA的合成  45-46
    2.2 干扰效应的验证  46-49
  3 讨论  49-50
第五章全文总结  50-51
参考文献  51-58
致谢  58-59
个人简介  59

南方根结线虫部分FLP神经肽受体基因的克隆和初步功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文