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稳定干扰端粒酶催化亚基及转录因子对SGC-7901细胞增殖和端粒酶活性的影响

作　者: 钱晓彬
导　师: 冯振卿；许文荣
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理学
关键词: 肿瘤基因治疗 RNA干扰(RNAi) 端粒酶催化亚基(hTERT) 端粒酶调节相关基因(TRAP)
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

利用RNAi技术高效、特异地阻断癌基因表达是治愈肿瘤的希望。研究表明，85％以上的恶性肿瘤组织表达端粒酶活性，而正常组织细胞缺乏端粒酶活性。端粒酶催化亚基hTERT是端粒酶的核心组分，也是端粒酶活性的限速因子，在80％～90％的肿瘤细胞中表达，在细胞永生化和肿瘤形成中起主要作用，因此成为理想的抑瘤靶点。hTERT基因表达调控主要分为两个关键阶段：转录激活因子对hTERT启动子的激活—启动转录；转录后水平的调控。由于端粒酶活性抑制与细胞增殖抑制之间存在“滞后现象”，长效的端粒酶活性抑制是获得较好的抗癌效果的保证。本研究利用载体表达的shRNA可以在细胞内稳定表达，具有长效干扰作用的特性，拟在hTERT基因表达调控的两个关键环节对hTERT基因表达进行干预，探讨其抗肿瘤效应。1、构建靶向hTERT、TRAP基因的shRNA表达载体psi-hTERT、psi-TRAP化学合成编码靶向端粒酶hTERT及其转录激活因子基因TRAP mRNA序列的短发夹寡核苷酸序列（各63个碱基），经退火后克隆到线性化的psilencer^TM2.1-U6 neo表达载体。重组构建的psi-hTERT、psi-TRAP载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明63个碱基对成功插入到预计位点，并且序列完全一致。说明成功构建了psi-hTERT、psi-TRAP shRNA表达质粒。2、psi-hTERT对SGC-7901细胞端粒酶活性和细胞增殖的长效影响将构建的psi-hTERT1和psi-hTERT2用脂质体转染SGC-7901细胞，然后用G418筛选，获得稳定表达克隆后，半量G418压力培养3个月，real-time PCR检测hTERT基因mRNA表达，western blot检测hTERT蛋白水平、TRAP-ELISA方法检测细胞端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖活性。实验结果显示，稳定转染psi-hTERT的实验组与对照组比较，hTERT mRNA表达水平psi-hTERT1组下降75.1％，psi-hTERT2组下降85.9％，hTERT蛋白psi-hTERT1组下降68.6％，psi-hTERT2组下降80.4％，端粒酶活性水平psi-hTERT1组下降36.36％，psi-hTERT2组下降51.19％，均具有显著性差异。与对照组比较，两实验组细胞增殖明显减慢，细胞凋亡率增加。结果提示，设计的针对hTERT基因的两对靶序列是有效的，载体表达的shRNA在SGC-7901细胞内具有长效的端粒酶活性抑制作用和抗肿瘤效应，hTERT是肿瘤基因治疗的有效靶点。3、psi-TRAP对SGC-7901细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响将构建的psi-TRAP1和用psi-TRAP2脂质体转染SGC-7901细胞，然后用G418筛选，获得稳定表达克隆后，半量G418压力培养3个月，real-time PCR方法检测TRAP基因、hTERT基因的mRNA水平实验结果显示，psi-TRAP1组抑制效率达85.0％；psi-TRAP2组抑制效率为54.6％。hTERT基因的mRNA水平也下降，psi-TRAP1组为0.136±0.02、psi-TRAP2组为0.315±0.03，明显低于psi-control组0.382±0.03。Western blot检测hTERT蛋白水平，psi-TRAP1组0.463±0.01，psi-TRAP2组1.35±0.04，psi-control组为1.980±0.01。TRAP-ELISA检测细胞端粒酶活性，psi-TRAP1组抑制率达36.3％，psi-TRAP2组抑制率为7.1％。实验组与对照组之间均有统计学差异（P＜0.05）。与对照组比较，实验组细胞增殖减慢，细胞凋亡率增加。结果提示：设计针对TRAP基因的两对靶序列也是有效的，可以显著性降低TRAP基因的表达，从而下调hTERT基因启动子活性，降低hTERT基因的转录水平，使hTERT mRNA和蛋白水平降低，细胞端粒酶的活性下降，具有抗肿瘤效应，是肿瘤基因治疗的又一途径。4、联合干扰hTERT不同靶序列及其转录激活因子基因TRAP对SGC-7901细胞的影响为了寻找更为有效的端粒酶抑制途径，探讨同时干扰hTERT基因及其转录激活因子基因TRAP是否具有协同下调端粒酶活性的作用，我们将psi-hTERT1分别与psi-hTERT2和psi-TRAP1联合共转染SGC-7901细胞，检测其对hTERT基因表达、端粒酶活性、SGC-7901细胞增殖的影响。实验结果表明，两联合干扰组与对照组比较，hTERT基因的表达在mRNA、蛋白水平明显下调，细胞增殖减慢，细胞凋亡率增加。但psi-hTERT1联合psi-TRAP1组与对照组比较无显著性差别。5、稳定干扰hTERT联合化疗药物对SGC-7901细胞增殖活性的影响选择两种常用的化疗药物DDP、5-FU分别联合psi-hTERT1和psi-hTERT2，探讨psi-hTERT表达载体对化疗药物的增敏作用，MTT检测结果表明psi-hTERT可以提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。综上所述，hTERT是肿瘤治疗的理想靶点；psi-hTERT和psi-TRAP具有长效抗增殖活性和化疗增敏作用，针对hTERT及其转录激活基因TRAP的RNA干扰策略是一种有效的肿瘤生物治疗方法。多基因联合或联合化疗可能是肿瘤治疗发展的趋势。

全文目录

一、中文摘要  4-8
二、英文摘要  8-12
三、前言  12-18
四、正文  18-102
  实验1 干扰端粒酶催化亚基hTERT对SGC-7901细胞增殖和端粒酶活性的长效影响  18-61
    材料与方法  18-38
    结果  38-48
    讨论  48-54
    小结  54-55
    参考文献  55-61
  实验2 干扰端粒酶调节相关基因TRAP对hTERT基因表达及SGC-7901细胞增殖的影响  61-78
    材料与方法  61-64
    结果  64-68
    讨论  68-73
    小结  73
    参考文献  73-78
  实验3 联合干扰hTERT不同靶序列及其转录激活因子TRAP基因对SGC-7901细胞的影响  78-89
    材料与方法  78-79
    结果  79-81
    讨论  81-84
    小结  84
    参考文献  84-89
  实验4 稳定干扰hTERT联合化疗药物对SGC-7901细胞增殖活性的影响  89-102
    材料与方法  89-91
    结果  91-92
    讨论  92-95
    小结  95
    参考文献  95-102
五、附录  102-103
六、致谢  103-104
七、文献综述  104-134
  综述1、端粒酶催化亚基在肿瘤基因治疗中的研究进展  104-118
  综述2、RNAi技术在肿瘤治疗方面的研究  118-134

稳定干扰端粒酶催化亚基及转录因子对SGC-7901细胞增殖和端粒酶活性的影响

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