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a凝集素表面展示南极假丝酵母脂肪酶及发酵优化

作　者: 宋燕
导　师: 林影
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: CALB a凝集素酿酒酵母表面展示发酵
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

1背景及目的南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B,CALB)是目前应用最广泛的、最具潜力的商业脂肪酶之一。它对于非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活力,并且具有良好的稳定性,在转酯等反应中显示出优于其他脂肪酶的性质。目前,CALB游离脂肪酶已在大肠杆菌、酵母等系统中获得表达,但是分离纯化困难、固定化酶生产成本高一直都是制约CALB工业化应用的瓶颈。本研究的目的是采用微生物固定化脂肪酶方法,利用酿酒酵母作为微生物固定化载体,将CALB展示在酵母细胞表面,成为全细胞催化剂,并进行低成本工业化培养基发酵培养。2方法及结果根据CALB的成熟多肽序列,人工优化并合成calb基因(仅成熟肽),将其克隆到质粒pYD1中的AGA2基因下游,重组质粒转化S. cerevisiae EBY100菌株,构建表面展示CALB的酵母工程菌株;通过传代培养筛选遗传学稳定性良好的重组菌株。选用工业化培养基进行重组菌的发酵优化实验。最终确定发酵条件为:pH5.0,接种量10%,溶解氧大于30%,在重组酿酒酵母生长阶段,发酵温度控制在28℃,并采用葡萄糖浓度反馈方式进行补料,经过22h的培养后,细胞光密度OD600可达到36.5,开始补加半乳糖诱导CALB的表达;在目的蛋白表达阶段,发酵温度则控制在25℃,半乳糖浓度2%。经过在2.5L发酵罐中经过82h发酵,细胞OD600可达到53.3,目的蛋白CALB的酶活力达到4.25U/ml。3意义以酿酒酵母表面展示系统固定化南极假丝酵母脂肪酶,生产工艺简单,不必分离纯化蛋白,大大降低酶生产成本,并且酿酒酵母已广泛应用于医药、食品行业,具有良好的生物安全性和环境保护作用。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章绪论  11-30
  1.1 脂肪酶  11-14
    1.1.1 脂肪酶简介  11
    1.1.2 脂肪酶催化  11
    1.1.3 南极假丝酵母脂肪酶B 介绍  11-13
    1.1.4 脂肪酶应用  13-14
  1.2 固定化脂肪酶技术  14-16
    1.2.1 固定化脂肪酶优点  14
    1.2.2 固定化方法  14-16
  1.3 酵母细胞表面展示系统介绍  16-21
    1.3.1 酵母表面展示的理论基础  16-17
    1.3.2 酵母表面展示系统类型  17-19
    1.3.3 酵母表面展示系统的应用  19-21
  1.4 工程菌发酵工艺综述  21-27
    1.4.1 培养基  21-22
    1.4.2 培养条件  22-24
    1.4.3 补料工艺  24-27
  1.5 本论文的研究目的和意义  27-30
    1.5.1 现阶段的主要问题  27-28
    1.5.2 本论文的主要研究内容  28
    1.5.3 本研究的技术路线  28-29
    1.5.4 本研究的意义  29-30
第二章 CALB基因的克隆及表达载体的构建  30-42
  2.1 引言  30
  2.2 实验材料  30-32
    2.2.1 菌株及质粒  30
    2.2.2 主要试剂  30
    2.2.3 培养基及常用溶液配制  30-31
    2.2.4 主要仪器  31-32
  2.3 实验方法  32-38
    2.3.1 CALB 基因密码子优化及引物设计  32-33
    2.3.2 CALB 基因的获取  33-35
    2.3.3 构建重组质粒  35-37
    2.3.4 转化大肠杆菌DH5α  37-38
    2.3.5 重组质粒的验证  38
  2.4 结果与分析  38-41
    2.4.1 calb 基因密码子优化结果  38-40
    2.4.2 CALB 基因梯度 PCR 结果  40
    2.4.3 载体质粒与目的基因双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果  40-41
  2.5 小结  41-42
第三章 CALB重组质粒在 EBY100中的表达  42-51
  3.1 引言  42
  3.2 实验材料  42-43
    3.2.1 菌株及质粒  42
    3.2.2 主要试剂  42
    3.2.3 培养基配制  42-43
    3.2.4 主要仪器  43
  3.3 实验方法  43-47
    3.3.1 酿酒酵母感受态制备  43-44
    3.3.2 空质粒pYD1、重组质粒pYD1-CALB 分别转化 EBY100  44
    3.3.3 重组菌株菌落PCR 验证  44-45
    3.3.4 重组子的筛选  45
    3.3.5 表达产物酶活测定  45-46
    3.3.6 半乳糖诱导脂肪酶基因在酿酒酵母中的表达  46-47
    3.3.7 遗传稳定性检测  47
  3.4 结果与分析  47-49
    3.4.1 重组酵母菌落PCR 结果  47-48
    3.4.2 重组子的筛选  48
    3.4.3 重组酵母的酶活测定  48-49
    3.4.4 酵母转化子的遗传稳定性分析  49
  3.5 小结  49-51
第四章工业化培养基发酵及优化  51-59
  4.1 引言  51
  4.2 菌种和培养基  51-52
    4.2.1 菌种  51
    4.2.2 培养基配制  51-52
  4.3 主要仪器  52
  4.4 实验方法  52-55
    4.4.1 菌种活化  52
    4.4.2 工程菌的种子液制备  52
    4.4.3 DNS 法测定葡萄糖浓度  52-53
    4.4.4 pH、溶解氧、温度的在线检测  53-54
    4.4.5 工程菌的发酵罐培养及目的蛋白的诱导表达优化  54-55
  4.5 结果与讨论  55-57
    4.5.1 接种量对酵母生长的影响  55-56
    4.5.2 温度对酶活影响  56
    4.5.3 批次补料发酵试验  56-57
  4.6 小结  57-59
结论与展望  59-61
参考文献  61-67
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果  67-68
致谢  68

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