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表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母的发酵优化

作　者: 冯琮
导　师: 林影
学　校: 华南理工大学
专　业: 发酵工程
关键词: 发酵优化 酵母表面展示 南极假丝酵母脂肪酶B 高密度
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


酵母表面展示技术(Yeast surface display technology)作为真核展示系统,已逐渐成为现代生命科学领域一种十分有效的展示技术。近十几年来,随着酵母表面展示技术的不断改进和完善,该技术在许多领域都得到了广泛应用。其中利用毕赤酵母表面展示技术展示各种功能蛋白具有更大的优越性,在国内外研究中都取得了较大进展。南极假丝酵母脂肪酶B在众多脂肪酶是途最为广泛的一种,对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。将其展示于毕赤酵母表面展示,不但实现了自固定化,耐热性和催化活性也有改善。但对展示于毕赤酵母的表面的酶的发酵优化,特别是针对展示于毕赤酵母的南极假丝酵母脂肪酶B,国内外尚未报道。本研究的思路是根据Invitrogen公司提供的《毕赤酵母实验操作手册》和《毕赤酵母发酵工艺手册》,分别先在摇瓶水平对培养基主要成分和发酵条件进行单因素优化,找到最适水平的同时发现关键因素。然后再放大到2L规模,并利用发酵罐探索甘油和甲醇补料的最佳流加模式,最后在50L的发酵罐实现放大。本研究首先对表面展示CALB的毕赤酵母突变菌株KFS-CALB-GS115摇瓶水平的BMGY/BMMY培养基及发酵条件进行了单因素优化,发现KFS-CALB-GS115摇瓶水平的最适培养基条件及发酵条件为甘油添加量2%(w/v),甲醇添加量2%(v/v),接种量4%(v/v),装液量12.5mL,转速300rpm诱导初始pH=6.5, KFS-CALB-GS115水解酶活力明显高于原条件,达到916.3U/g,相比原条件556.9 U/g提高了65%。通过对比优化前后全细胞催化合成己酸乙酯的合成效率发现,反应3h后,优化条件下的底物转化率达到70%,而原条件下只有28%,同时优化条件下4小时转化率就能达到80%以上,比原条件提前1.5h以上。对比优化前后KFS-CALB-GS115的蛋白表达量可以看出,优化条件下的蛋白条带清晰度略好于原条件。本研究同时对另一株表面展示CALB的毕赤酵母突变菌株KNS-CALB-GS115(比KNS-CALB-GS115合成活力更高,但水解活力偏低)高密度发酵的BSM培养基及相应发酵条件进行了优化。首先通过摇瓶模拟发酵罐的甘油分批培养,考察了BSM培养基中几种重要成分的含量,然后利用多功能补料摇床能够在线检测并且自动控制发酵pH的优点,分别考察了KNS-CALB-GS115在生长和产酶阶段分别的最适pH值和最适温度。通过单因素实验发现,KNS-CALB-GS115摇瓶水平的最适BSM培养基条件及发酵条件为:甘油含量40g/L,硫酸铵含量4 g/L,硫酸钙含量10 mmol/L,PTM1含量4 mL/L,最适生长和产酶温度30℃,最适生长pH=5.5,最适产酶pH=7.0。优化后甘油利用率高6.4%,达到95.3%,菌体干重提高4.5%达到19.92g/L,CALB水解活力提高60.3%达到100.3 U/g。然后,将KNS-CALB-GS115的BSM培养基的主要成分和培养条件的优化应用于在2L发酵罐条件下,能够有效提高菌体的生长效率,对后期菌体的产酶起到促进作用。最高酶活力可达305.9U/g,较未优化条件下相比,单位菌体酶活力提高了27.2%。提高甘油流加阶段的流速至9.6mL/(L?h)并延长流加甘油的时间至12h能够有效地快速富集菌体,菌体量的增加有效地提高了了后期酶表达量。菌体最优的酶活力可以达到317.3U/g;采取6.4mL/(L?h)恒速流加甲醇的方式比恒定溶氧法菌体上的CALB表达量有效提高,菌体最优的酶活力可以达到348.4U/g;通过对比优化前后细胞表面荧光强度,优化后的荧光峰明显向右漂移,验证了展示酶活力的提高是由于细胞表面蛋白表达量有了提高;通过对比优化前后CALB全细胞催化合成己酸乙酯合成效率,在反应开始1h左右转化率可以提高18%。说明优化条件下CALB表达量的提高可以明显提高单位菌体的催化合成活性。采用50L发酵罐扩大培养,酶活力达到256.5U/g,低于2L发酵罐水平,并未达到预期的放大效果。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-16
第一章 绪论  16-31
  1.1 脂肪酶的研究进展  16-18
    1.1.1 脂肪酶的简介  16-17
    1.1.2 脂肪酶的结构  17
    1.1.3 脂肪酶的性质  17
    1.1.4 脂肪酶的应用  17-18
  1.2 微生物脂肪酶研究进展  18-20
    1.2.1 微生物脂肪酶的来源  18-19
    1.2.2 微生物脂肪酶发酵生产研究进展  19-20
  1.3 酵母表面展示系统的研究进展  20-21
    1.3.1 酵母表面展示系统简介  20-21
    1.3.2 酵母展示系统的应用  21
  1.4 南极假丝酵母脂肪酶B 的研究进展  21-24
    1.4.1 南极假丝酵母脂肪酶B 简介  21
    1.4.2 南极假丝酵母脂肪酶B 分子结构  21-22
    1.4.3 CALB 催化的非特异性与立体选择性  22-23
    1.4.4 CALB 的应用研究  23-24
    1.4.5 酵母展示CALB 的研究进展  24
  1.5 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白及发酵优化研究进展  24-29
    1.5.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性  24-25
    1.5.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优点  25-26
    1.5.3 巴斯德毕赤酵母发酵优化的研究进展  26-29
  1.6 本课题研究的意义及主要内容  29-31
    1.6.1 本课题研究的意义  29
    1.6.2 本课题研究的内容  29-31
第二章 重组毕赤酵母KFS-CALB-GS115 摇瓶水平BMGY/BMMY 培养基及发酵条件优化  31-46
  2.1 引言  31
  2.2 实验材料与设备  31-34
    2.2.1 主要仪器和设备  31-32
    2.2.2 实验菌种  32
    2.2.3 主要试剂  32-33
    2.2.4 溶液与培养基  33-34
      2.2.4.1 培养基的配置  33-34
      2.2.4.2 溶液的配制  34
  2.3 实验方法  34-37
    2.3.1 培养方法  34-36
      2.3.1.1 菌种保藏  34
      2.3.1.2 YPD 平板活化菌种  34-35
      2.3.1.3 YPD 种子液培养  35
      2.3.1.4 BMGY 菌体富集培养  35
      2.3.1.5 BMMY 诱导培养  35
      2.3.1.6 冻干全细胞催化剂制备  35
      2.3.1.7 重组毕赤酵母KFS-CALB-GS115 全细胞催化合成己酸乙酯反应  35
      2.3.1.8 pNP 标准曲线的绘制  35-36
    2.3.2 参数检测及分析方法  36-37
      2.3.2.1 细胞密度的测定  36
      2.3.2.2 CALB 水解活力测定  36
      2.3.2.3 重组毕赤酵母KFS-CALB-GS115 全细胞催化合成己酸乙酯检测  36
      2.3.2.4 重组毕赤酵母KFS-CALB-GS115 胞壁蛋白的提取  36
      2.3.2.5 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  36-37
  2.4 实验结果与讨论  37-44
    2.4.1 pNP 标准曲线的绘制  37-38
    2.4.2 重组毕赤酵母 KFS-CALB-GS115 的摇瓶水平 BMGY/BMMY 培养基优化  38-39
      2.4.2.1 BMGY 培养基中甘油含量对KFS-CALB-GS115 生长的影响  38
      2.4.2.2 BMMY 培养基中甲醇含量对KFS-CALB-GS115 产酶的影响  38-39
    2.4.3 重组毕赤酵母KFS-CALB-GS115 摇瓶水平培养条件优化  39-42
      2.4.3.1 接种量对KFS-CALB-GS115 产酶的影响  39-40
      2.4.3.2 装液量对KFS-CALB-GS115 产酶的影响  40-41
      2.4.3.3 转速对KFS-CALB-GS115 产酶的影响  41
      2.4.3.4 初始pH 值对KFS-CALB-GS115 产酶的影响  41-42
    2.4.4 培养基及发酵条件优化后KFS-CALB-GS115 的水解及合成活力验证  42-44
      2.4.4.1 培养基及发酵条件优化后的KFS-CALB-GS115 水解活力验证  42-43
      2.4.4.2 培养基及发酵条件优化后KFS-CALB-GS115 的合成活力验证  43-44
      2.4.4.3 培养基及发酵条件优化后胞壁蛋白的SDS-PAGE 对比  44
  2.5 本章小结  44-46
第三章 重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 摇瓶水平的BSM 培养基及发酵条件优化  46-58
  3.1 引言  46-47
  3.2 实验材料与设备  47-48
    3.2.1 主要仪器和设备  47
    3.2.2 实验菌种  47
    3.2.3 主要试剂  47-48
    3.2.4 溶液与培养基  48
      3.2.4.1 培养基的配置  48
      3.2.4.2 溶液的配制  48
  3.3 实验方法  48-49
    3.3.1 培养方法  48-49
      3.3.1.1 菌种保藏  48
      3.3.1.2 YPD 平板活化菌种  48
      3.3.1.3 YPD 种子液培养  48
      3.3.1.4 BSM 摇瓶培养  48
      3.3.1.5 多功能补料摇床培养  48-49
    3.3.2 参数检测及分析方法  49
      3.3.2.1 细胞密度的测定  49
      3.3.2.2 CALB 水解活力测定  49
      3.3.2.3 甘油残量测定方法  49
      3.3.2.4 pH 值在线测量  49
  3.4 实验结果与讨论  49-56
    3.4.1 KFS-CALB-GS115 与KNS-CALB-GS115 合成活力对比  49-50
    3.4.2 BSM 培养基主要成分优化  50-53
      3.4.2.1 BSM 培养基中硫酸铵含量对KNS-CALB-GS115 生长的影响  50-51
      3.4.2.2 BSM 培养基中Ca2+含量对KNS-CALB-GS115 生长的影响  51
      3.4.2.3 BSM 培养基中PTM1 含量对KNS-CALB-GS115 生长的影响  51-52
      3.4.2.4 BSM 培养基中甘油含量对KNS-CALB-GS115 生长的影响  52-53
    3.4.3 BSM 培养基条件下KNS-CALB-GS115 发酵条件优化  53-56
      3.4.3.1 BSM 培养基条件下KNS-CALB-GS115 生长最适温度研究  53-54
      3.4.3.2 BSM 培养基条件下KNS-CALB-GS115 生长最适pH 值研究  54
      3.4.3.3 BSM 培养基条件下KNS-CALB-GS115 最适产酶温度的研究  54-55
      3.4.3.4 BSM 培养基条件下KNS-CALB-GS115 最适产酶pH 的研究  55-56
  3.5 本章小结  56-58
第四章 重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 发酵罐高密度发酵优化  58-70
  4.1 引言  58-59
  4.2 实验材料与设备  59-60
    4.2.1 主要仪器和设备  59
    4.2.2 实验菌种  59
    4.2.3 主要试剂  59
    4.2.4 溶液与培养基  59-60
      4.2.4.1 培养基的配置  59
      4.2.4.2 溶液的配制  59-60
  4.3 实验方法  60-61
    4.3.1 培养方法  60-61
      4.3.1.1 菌种保藏  60
      4.3.1.2 YPD 平板活化菌种  60
      4.3.1.3 YPD 种子液培养  60
      4.3.1.4 2L 发酵罐培养  60
      4.3.1.5 50L 发酵罐扩大培养  60-61
    4.3.2 检测方法  61
      4.3.2.1 细胞密度的测定  61
      4.3.2.2 CALB 水解活力测定  61
      4.3.2.3 pH 值在线测量  61
      4.3.2.4 细胞表面荧光强度检测  61
  4.4 实验结果与讨论  61-68
    4.4.1 BSM 优化培养基和培养条件在2L 发酵罐上的验证  61-63
      4.4.1.1 BSM 原培养基和原培养条件在2L 发酵罐上的发酵  61-62
      4.4.1.2 BSM 优化条件和原条件在2L 发酵罐上的发酵  62-63
    4.4.2 2L 发酵罐下甘油分批补料培养阶段甘油流加模式优化  63-65
      4.4.2.1 不同甘油流速对重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 生长的影响  63-64
      4.4.2.2 不同甘油流加时间对重组毕赤酵母 KNS-CALB-GS115 产酶的影响  64-65
    4.4.3 2L 发酵罐下甲醇流加模式对KNS-CALB-GS115 产酶的影响  65-66
    4.4.4 重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 发酵优化前后结果对比  66
    4.4.5 重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 细胞表面荧光强度检测  66-67
    4.4.6 重组毕赤酵母KNS-CALB-GS115 全细胞催化合成己酸乙酯  67-68
  4.5 本章小结  68-70
结论与展望  70-73
参考文献  73-79
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果  79-80
致谢  80

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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