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分节丝状菌Segmented filamentous bacteria（SFB）与肉鸡肠道黏膜免疫系统的关系及其体外培养

作　者: 廖宁波
导　师: 王欣；孙国昌
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 分解丝状菌(SFB) 肠道黏膜免疫系统 荧光原位杂交(FISH) 荧光定量PCR(qPCR) 分泌型免疫球蛋白A(SIgA) 体外培养模型
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


分节丝状菌segmented filamentous bacteria (SFB)是广泛存在于人或多种脊椎动物肠道内的一类形态结构特异的“土著”细菌。尽管早在1849年,leidy就在白蚁肠道内观察到了一种“内生植物体”状细菌,但是直到现在,人们仍然未能在体外培养这种肠道微生物。然而悉生动物模型研究证明SFB直接参与宿主肠道免疫系统的成熟,尤其是影响宿主免疫球蛋白SIgA的分泌,这表明SFB可能直接参与幼小动物天然免疫系统的成熟。所以,SFB的研究引起了科学家们的广泛兴趣。因此深入研究SFB的体外培养以及其与宿主之间的相互关系,对开发新一代微生态免疫调节剂有着重要的现实与应用意义。由于传统细菌培养的方法非常有限,以致于到目前为止分节丝状菌(SFB)还未能进行纯培养,而且其生活环境非常复杂,因此本研究主要内容包括建立分子生物学方法对AA肉鸡肠道内的分节丝状菌进行原位杂交(FISH)和定量计数(Real-timePCR),同时在AA肉鸡的生长过程中采用不同的干预方法,研究SFB与宿主免疫之间的关系。另外还运用肠道微生态体外模拟模型进行分节丝状菌(SFB)的体外培养。具体结果如下：1、建立了肉鸡肠道分节丝状菌的荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR(qPCR)和变形梯度凝胶电泳(DGGE)的检测方法,检测SFB在肠道不同解剖位置的分布及随肉鸡生长的动态变化情况。结果表明,SFB主要分布在AA肉鸡回肠末端的黏膜表面,在肉鸡的生长过程中,SFB的出现和消失也存在一定的规律性。2、检测AA肉鸡不同干涉组中肠道黏膜表面SIgA含量和SFB数量随日龄的变化情况。在本试验中将刚出壳的AA肉鸡随机分为三组,CL(对照组)、CTX(免疫抑制组)、LAC(乳酸菌组),通过检测各组鸡的体重及白血球的数量来确定干预作用的效果,我们检测了三组不同日龄的AA肉鸡肠道回肠末端粘膜表面SIgA含量,发现CTX组随着日龄的升高SIgA的含量也有增高的趋势,而CL和LAC组回肠末端粘膜表面SIgA的含量在第9-13天时达到最高,之后逐渐降低到一定的水平。同时我们用FISH和Real-time PCR方法对SFB做了检测,结果发现LAC组中SFB占总菌数的百分含量出现最高峰的时间要比CL、CTX都要早,此外,随着日龄的升高,LAC、CL组中的SFB逐渐降低,而CTX组中SFB却是逐渐升高的趋势,但当到了干涉后期,改变免疫抑制剂的含量时,SIgA的含量迅速升高使得SFB的含量迅速降低到正常水平,由此可见SIgA对调节SFB的数量有一定的作用。3、尝试对SFB菌群的体外厌氧连续发酵培养,包括对培养基的优化及培养条件的进一步摸索。通过肠道微生物体外培养模型对分节丝状菌(SFB)进行体外培养,尝试不同离子及抗生素对分节丝状菌(SFB)的影响,结果表明,在基础培养基(HBCT)中,参入K+、Mg2+、Ca2+离子,培养至第7天,用FISH方法能够检测到SFB的存在,Co2+、Cu2+等离子则没有SFB杂交信号。在离子培养基中(IL),加入环磷酰胺、卡那霉素、氨苄青霉素,培养至第7天也能检测到SFB的存在,葡萄糖、淀粉等则无杂交信号。虽然目前对SFB的体外培养仍有不少问题,但现在的结果对下一步的培养工作将有重要的指导意义。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
前言  10-11
第一章 文献综述  11-24
  1 肠道微生态理论  11-15
    1.1 肠道微生态的提出  11
    1.2 肠道微生态的研究现状  11-14
    1.3 肠道微生物菌群的功能  14-15
  2 肠道黏膜免疫系统  15-19
    2.1 肠道黏膜免疫系统的组成  15-16
    2.2 肠道黏膜免疫应答中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)  16-17
    2.3 肠道黏膜免疫系统与肠道微生物的关系  17-19
  3 正常宿主肠道内分节丝状菌(SFB)的生物学特性  19-24
    3.1 分节丝状菌(SFB)的生存特性及生活史  19-20
    3.2 分节丝状菌(SFB)系统分类学上的地位  20-21
    3.3 分节丝状菌(SFB)与宿主肠道黏膜免疫系统的关系  21-22
    3.4 分节丝状菌(SFB)在肠道微生态稳态中的作用  22
    3.5 分节丝状菌(SFB)的研究方法及待解决的问题  22-24
第二章 试验研究  24-76
  第一节 分节丝状菌(SFB)的鉴定及其在鸡肠道中的动态变化  24-54
    1 材料与方法  24-40
      1.1 材料  24-27
        1.1.1 耗材  24-25
        1.1.2 试剂  25-26
        1.1.3 试验动物  26
        1.1.4 主要仪器和设备  26-27
      1.2 试验方法  27-40
        1.2.1 SFB菌群的形态观察  27-28
        1.2.2 SFB菌群的分子鉴定  28-32
        1.2.3 SFB菌群的多样性分析  32-35
        1.2.4 SFB菌群的荧光标记  35-37
        1.2.5 SFB菌群的定量检测  37-40
        1.2.6 统计学分析  40
    2 结果与分析  40-52
      2.1 SFB菌群的形态  40-41
      2.2 SFB菌群的分子检测  41-44
        2.2.1 肉鸡肠道菌群基因组DNA  41-42
        2.2.2 SFB引物的特异性  42-43
        2.2.3 SFB在不同日龄鸡肠道内的检测  43-44
      2.3 SFB菌群多样性分析  44-45
        2.3.1 带GC夹子SFB特异引物的PCR  44
        2.3.2 SFB的变性梯度凝胶电泳(DGGE)  44-45
      2.4 SFB菌群的荧光标记  45-47
        2.4.1 SFB探针的特异性  45-46
        2.4.2 SFB的荧光原位杂交  46
        2.4.3 SFB在正常鸡肠道内的分布  46-47
      2.5 SFB菌群的定量检测  47-52
        2.5.1 荧光定量PCR引物的选择  47-49
        2.5.2 含特异DNA片段克隆载体的构建  49
        2.5.3 荧光定量PCR标准曲线建立及灵敏度的确定  49-50
        2.5.4 荧光定量PCR(qPCR)与荧光原位杂交(FISH)在菌落计数中的比较  50-51
        2.5.5 SFB在不同日龄的正常鸡肠道内的动态变化  51-52
    3 讨论  52-54
      3.1 荧光原位杂交(FISH)与荧光定量PCR(qPCR)在检测SFB中的运用  52
      3.2 SFB在正常鸡肠道内的动态变化  52-54
        3.2.1 SFB在鸡肠道内的分布  52-53
        3.2.2 SFB在正常鸡肠道内的动态变化  53-54
  第二节 分节丝状菌(SFB)与鸡肠道黏膜免疫系统成熟的关系  54-68
    1 材料与方法  54-59
      1.1 材料  54-55
        1.1.1 耗材  54
        1.1.2 试剂  54-55
        1.1.3 试验动物  55
        1.1.4 主要仪器和设备  55
      1.2 试验方法  55-59
        1.2.1 鸡肠道黏膜免疫系统的干涉试验  55-56
        1.2.2 鸡肠道内SIgA含量的检测  56-58
        1.2.3 不同干涉组鸡肠道黏膜表面SFB含量的检测  58
        1.2.4 鸡肠道菌群差异的PCR-DGGE检测  58-59
    2 结果与分析  59-64
      2.1 鸡肠道黏膜免疫系统的干涉试验  59-60
        2.1.1 各组间体重的差异  59-60
        2.1.2 各组间白细胞的差异  60
      2.2 不同组间鸡肠道内SIgA含量的检测  60-62
        2.2.1 SIgA标准曲线的绘制  60-61
        2.2.2 不同干涉组鸡肠道内SIgA含量的变化  61-62
      2.3 不同组之间鸡肠道内SFB的检测  62-63
      2.4 不同干涉组之间的菌群差异  63-64
        2.4.1 PCR-DGGE检测结果  63-64
    3 讨论  64-68
      3.1 乳酸菌与宿主黏膜免疫系统关系  64-65
      3.2 环磷酰胺对动物免疫系统成熟的影响  65-66
      3.3 分节丝状菌(SFB)对肉鸡肠道黏膜免疫系统成熟的影响  66-68
  第三节 分节丝状菌(SFB)的体外培养  68-76
    1 材料与方法  68-72
      1.1 材料  68-69
        1.1.1 耗材  68
        1.1.2 试验动物及试培养菌群  68-69
        1.1.3 培养基  69
        1.1.4 药品及试剂  69
        1.1.5 主要仪器和设备  69
      1.2 方法  69-72
        1.2.1 取样  69
        1.2.2 培养基的配置  69-70
        1.2.3 体外厌氧静置培养  70-71
        1.2.4 体外厌氧连续发酵培养  71-72
    2 结果与分析  72-74
      2.1 体外厌氧静置培养  72-73
        2.1.1 液体培养  72-73
        2.1.2 固体培养  73
      2.2 体外厌氧连续发酵培养  73-74
    3 讨论  74-76
第三章 文章总结  76-80
  1 分节丝状菌(SFB)在正常鸡肠道内的动态变化  76
  2 分节丝状菌(SFB)与鸡肠道黏膜免疫系统成熟的关系  76-77
  3 分节丝状菌(SFB)的体外试培养  77-78
  4 前景展望  78-80
参考文献  80-88
附录一:DGGE相关试剂的配制  88-91
附录二:细菌、SFB、德氏乳酸杆菌的FISH图  91-94
附录三:各种发酵系统模型  94-96
致谢  96-97
攻读硕士学位期间发表的论文目录  97-98

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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