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林可霉素产生菌的基因改造

作　者: 杨洪涛
导　师: 何建勇
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 林可链霉菌 林可霉素 基因改造 透明颤菌血红蛋白
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


林可霉素(Lincomycin)是由林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的一类林可糖胺类抗生素，具有抗革兰氏阳性菌的作用。在林可链霉菌基因功能不完全明确，国内外研究报道较少的情况下，探索式的对林可链霉菌加以基因改造，期望提高林可霉素发酵产量，得到适应工业化发酵生产的菌株。本论文在林可霉素生物合成关键基因lmbH终止密码子后插入了一段去掉启动子的安普霉素抗性基因apr，使apr和lmbH处于同一转录单位。希望apr在lmbH的启动子的带动下转录并且表达，根据重组菌株抗安普霉素能力的强弱建立林可霉素高产菌株筛选模型。林可链霉菌发酵实验证实重组菌株具有了安普霉素抗性，但对浓度的敏感度较差，林可霉素的发酵产量下降为33％，因此该实验方案并未获得成功。本论文构建了带有红霉素抗性基因启动子PermE的透明颤菌血红蛋白基因vgb，并将它整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因melC中，希望失活melC的同时表达血红蛋白VHb。实验证实重组菌株不再产生黑色素，且VHb得到表达，表现出生物学活性。不同装瓶量摇瓶发酵实验表明在正常溶氧条件下重组菌株的林可霉素产量同对照菌株相近，但在低氧条件下表现出远高于对照菌株的林可霉素生产能力，说明该重组菌株具有在低溶氧条件下保持一定发酵水平的优良特性，具备工业化发酵生产的要求。因此该实验方案获得成功。

全文目录


中文摘要  10-11
Abstract  11-12
第一章 前言  12-27
  1.1 林可霉素研究进展  12-20
    1.1.1 林可霉素及产生菌概述  12-13
    1.1.2 林可霉素的生物合成过程  13-15
    1.1.3 林可霉素生物合成基因簇  15-19
    1.1.4 黑色素生物合成基因melC  19-20
  1.2 透明颤菌血红蛋白及其基因研究进展  20-25
    1.2.1 透明颤菌血红蛋白的结构及特性  20-21
    1.2.2 透明颤菌血红蛋白基因的克隆、表达和调控  21-23
    1.2.3 透明颤菌血红蛋白的作用机制  23-24
    1.2.4 透明颤菌血红蛋白及其基因的应用  24-25
  1.3 课题研究背景及立题依据  25-27
    1.3.1 研究背景  25
    1.3.2 立题依据  25-27
第二章 实验材料与方法  27-35
  2.1 实验材料  27-30
    2.1.1 菌种与质粒  27
    2.1.2 培养基  27-28
    2.1.3 试剂  28-29
    2.1.4 溶液  29
    2.1.5 主要仪器  29-30
  2.2 实验方法  30-35
    2.2.1 大肠杆菌质粒DNA小量提取  30
    2.2.2 链霉菌总DNA的提取  30-31
    2.2.3 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备和DNA转化  31-32
    2.2.4 DNA酶切和连接  32
    2.2.5 DNA电泳和凝胶片段回收  32
    2.2.6 PCR反应  32-33
    2.2.7 接合转移实验及双交换菌株的筛选  33-34
    2.2.8 链霉菌VHb表达的CO结合试验  34
    2.2.9 林可链霉菌发酵及检测操作的实验方法  34-35
第三章 实验结果与讨论  35-62
  3.1 利用分子生物学方法建立林可霉素高产菌株的筛选模型  35-48
    3.1.1 基因片段的获取  35-38
    3.1.2 重组质粒pHAKG132的构建  38-43
    3.1.3 接合转移实验  43
    3.1.4 双交换菌株的筛选及验证  43-45
    3.1.5 重组菌株发酵产物的HPLC分析  45-46
    3.1.6 小结及讨论  46-48
  3.2 林可链霉菌黑色素生物合成基因的失活和透明颤菌血红蛋白基因的表达  48-62
    3.2.1 基因片段的获得  48-51
    3.2.2 重组质粒pYHT04的构建  51-56
    3.2.3 接合转移实验  56
    3.2.4 双交换菌株的筛选  56-57
    3.2.5 vgb基因在林可链霉菌中表达的CO结合试验分析  57-58
    3.2.5 重组菌株发酵产物分析  58-60
    3.2.6 小结及讨论  60-62
第四章 结论  62-63
参考文献  63-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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