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甘蔗花叶病毒HC-Pro的GFP标记及其蚜传特性

作　者: 武科科
导　师: 吴云锋
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: SCMV HC-Pro GFP 重叠延伸PCR 蚜传实验
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 30次
引　用: 2次
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内容摘要

甘蔗花叶病毒(SCMV)是引起玉米矮花叶病的主要病原之一,也可以侵染甘蔗、高粱、谷子等禾本科作物和其它多种禾本科杂草。在自然条件下,依靠玉米蚜(Rhopalosiphum maidis (Fitch))、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi (L.))、麦二叉蚜(Schizaphis graminum (Rondani))、桃蚜(Myzus persicae (Sultzer))、棉蚜(Aphis gossypii Glover)等介体,以非持久性方式进行传播。SCMV属于Potyvirus,在被蚜虫传播时需要病毒编码的非结构蛋白辅助因子-蛋白酶(HC-Pro)的参与。HC-Pro是一种多功能蛋白,除了在蚜虫传播过程中起作用,还参与病毒侵染循环中的其它重要环节。本文克隆了SCMV陕西分离物的HC-Pro基因,构建了该基因的原核表达载体pGEX-HC-Pro,转化进E.coli BL21(DE3)pLysS中,进行诱导表达。并利用融合表达蛋白GST-HC-Pro,制备了效价为1:1280的家兔抗血清。利用重叠延伸PCR方法,将HC-Pro与GFP两个基因连接起来,插入到原核表达载体pGEX-4T-1中。重组质粒pGEX-HC-GFP在E.coli BL21(DE3)pLysS诱导表达,优化表达条件后,获得融合蛋白GST-HC-GFP。通过Western Blot证明,该蛋白能够与HC-Pro和GFP的抗血清发生特异性结合;诱导表达的菌体在蓝光或λ=390nm紫外光激发下发射出较强的绿色荧光;玉米蚜取食这种融合蛋白和SCMV病毒粒子后,接种到健康玉米幼苗上,引起植株发病(发病率为33.3%),RT-PCR检测后证实为SCMV,表明融合蛋白具有HC-Pro蚜传生物学活性。用融合蛋白GST-HC-GFP饲喂玉米蚜和禾谷缢管蚜,在这两种蚜虫下颚口针的近尖端部分观察到矩阵状排列的绿色荧光位点。体外结合方法可以获得同样的结果。利用该蛋白体外结合方法,在玉米上试探性取食的另外两种蚜虫,菊小长管蚜(Macrosiphoniella sanborni (Gillette))和萝卜蚜(Lipaphis erysimi (Kaltenbach))的口针的近尖端部分上也观察到有矩阵状排列的绿色荧光位点。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-24
  1.1 玉米矮花叶病的发生与分布  11
  1.2 玉米矮花叶病的病原及其分类地位、株系划分  11-13
  1.3 SCMV 的寄主范围  13-14
  1.4 传播途径  14-15
  1.5 防治措施  15
  1.6 玉米抗SCMV 的品种抗性研究  15-16
  1.7 SCMV 的分子生物学特性  16
  1.8 昆虫传播的植物病毒种类  16-19
  1.9 昆虫传播非循回型病毒的过程  19-22
  1.10 应用GFP 标记病毒对蚜虫机制的研究  22-24
第二章试验材料与方法  24-42
  2.1 试验材料  24
    2.1.1 病毒  24
    2.1.2 植物材料  24
    2.1.3 蚜虫材料  24
    2.1.4 菌种、质粒  24
  2.2 试剂与仪器  24-25
    2.2.1 试剂  24-25
    2.2.2 仪器  25
    2.2.3 培养基及各种缓冲液配置  25
  2.3 方法  25-42
    2.3.1 SCMV 陕西株系的可侵染性和可蚜传特性的鉴定  25-26
    2.3.2 几种蚜虫在玉米幼苗上的取食行为的差异性分析  26
    2.3.3 SCMV 陕西株系的HC-Pro 基因的克隆、原核表达与抗血清制备  26-34
    2.3.4 GFP 基因的原核表达和表达产物的特性分析  34-36
    2.3.5 HC-Pro 与GFP 的融合及其表达  36-40
    2.3.6 GFP 标记的HC-Pro 在几种蚜虫口针上的结合  40-42
第三章结果与分析  42-62
  3.1 可侵染性与可蚜传特性  42-43
    3.1.1 SCMV 的侵染活性  42
    3.1.2 SCMV 的蚜传特性  42-43
  3.2 在玉米幼苗上的取食行为差异  43-44
    3.2.1 蚜虫种类及其自然寄主  43
    3.2.2 蚜虫取食行为差异性  43-44
  3.3 SCMV HC-Pro 的克隆、原核表达和多克隆抗体的制备  44-50
    3.3.1 RNA 的提取  44
    3.3.2 HC-Pro 的克隆  44-47
    3.3.3 核酸与氨基酸的序列分析  47-48
    3.3.4 原核表达载体的构建  48
    3.3.5 pGEX-HC-Pro 的诱导表达和SDS-PAGE 分析  48-49
    3.3.6 多克隆抗体的效价测定和Western blot  49-50
  3.4 GFP 克隆、原核表达、表达产物的特性分析  50-52
    3.4.1 GFP 的克隆  50
    3.4.2 原核表达载体的构建、诱导表达  50-52
    3.4.3 pGEX-GFP 表达产物的Western Blot 和荧光特性  52
  3.5 HC-Pro 与 GFP 的融合表达  52-58
    3.5.1 重叠延伸PCR  52-53
    3.5.2 pGEX-HC-Pro 的构建  53-55
    3.5.3 pGEX-HC-GFP 的诱导表达  55-56
    3.5.4 pGEX-HC-GFP 表达产物的Western Blot 和荧光特性  56-58
    3.5.5 HC-GFP 的蚜传活性  58
  3.6 HC-Pro 在蚜虫口针上的定位  58-62
    3.6.1 in vivo 结合  58-60
    3.6.2 in vitro 结合  60-62
第四章结论与讨论  62-65
  4.1 结论  62
  4.2 讨论  62-65
    4.2.1 关于原核表达载体的构建  62
    4.2.2 关于原核载体在E.coli 中的诱导表达  62-63
    4.2.3 关于重叠延伸PCR 的应用和条件优化  63
    4.2.4 关于抗体制备  63
    4.2.5 关于传毒介体主要是蚜虫的长期活体保存、饲养  63
    4.2.6 关于病毒样品的保存  63
    4.2.7 关于荧光的观察  63
    4.2.8 蛋白的结合  63-64
    4.2.9 试剂配置  64-65
参考文献  65-68
附录  68-70
致谢  70-71
作者简介  71
硕士期间发表论文  71

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