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大麦黄矮病毒PAV株系CP与GFP融合基因构建和原核表达及其抗血清制备

作　者: 孙润红
导　师: 吴云锋
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 微生物
关键词: 大麦黄矮病毒-PAV CP GFP 融合PCR
分类号: S435.123
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 35次
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内容摘要

大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是一类+ssRNA病毒,至少有25种蚜虫以循环,非增值方式传播,分布广泛,是世界上危害最严重、流行最广泛的植物病毒之一。它在侵染小麦,大麦和燕麦时引起植株黄化和矮化。大麦黄矮病毒PAV(BYDV-PAV)可以由麦禾谷缢管蚜和麦长管蚜以循回非增殖型的方式传播。根据已报道的大麦黄矮病毒PAV株系(BYDV-PAV)相关基因序列,利用RT-PCR方法获得外壳蛋白基因,通过融合PCR方法将报告基因GFP置于大麦黄矮病毒PAV株系的外壳蛋白基因全长序列的下游,经双酶切、PCR鉴定及序列测定,成功构建大麦黄矮病毒PAV株系的外壳蛋白的绿色荧光蛋白基因表达体系,并转入E. Coli BL21(DE3)Plys S菌株中。SDS-PAGE胶、荧光显微镜及Western blot均检测到目的蛋白的表达。构建的CP-GFP融合基因在15-22℃条件下能表达出目标条带。但在23-37℃条件下不能够表达出目标条带。这些结果为利用GFP来进一步研究黄矮病毒PAV株系的病毒粒子在介体蚜虫体内的循环奠定了基础。利用融合表达蛋白CP-GFP- Pro,皮下注射家兔,琼脂双扩证明制备的抗血清效价为1:512。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 大麦黄矮病的生物学特性  10-12
  1.2 大麦黄矮病毒的基因组结构特征和基因功能  12-15
    1.2.1 与复制有关的蛋白  13
    1.2.2 与结构有关的蛋白  13-14
    1.2.3 与运动有关的蛋白  14-15
    1.2.4 P6 蛋白  15
    1.2.5 其他蛋白  15
  1.3 昆虫传播植物病毒种类  15-18
  1.4 蚜虫传播大麦黄矮病毒循环型过程  18-20
  1.5 本研究的目的和意义  20-21
第二章试验材料与方法  21-33
  2.1 试验材料  21
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 菌种和质粒  21
  2.2 试剂与仪器  21-22
    2.2.1 试剂  21
    2.2.2 仪器  21-22
    2.2.3 培养基及各种缓冲液配制  22
  2.3 方法  22-33
    2.3.1 BYDV PAV 株系CP 基因的获得  22-26
    2.3.2 GFP 基因的获得  26-27
    2.3.3 CP 与GFP 融合基因的构建  27-28
    2.3.4 稀有密码子及蛋白的理化性质分析  28
    2.3.5 CP-GFP 的原核表达  28-29
    2.3.6 诱导表达蛋白的SDS-PAGE 分析  29-30
    2.3.7 诱导菌液的荧光显微镜的观察  30
    2.3.8 表达蛋白的Western Blotting 检测  30-31
    2.3.9 CP-GFP 融合蛋白纯化和抗血清制备  31-32
    2.3.10 多克隆抗体的效价测定  32-33
第三章结果与分析  33-39
  3.1 RNA 的提取  33
  3.2 BYDV PAV 株系CP 基因的克隆  33-34
  3.3 GFP 基因的克隆  34
  3.4 CP 与GFP 的融合构建  34-35
  3.5 CP-GFP 融合基因的稀有密码子预测  35-36
  3.6 CP-GFP 融合蛋白的理化性质分析  36
  3.7 CP-GFP 基因在大肠杆菌中表达的检测结果  36-37
  3.8 荧光显微镜的观察结果  37
  3.9 Western blot 分析结果  37-38
  3.10 琼脂双扩结果  38-39
第四章结论与讨论  39-42
  4.1 结论  39
  4.2 讨论  39-42
    4.2.1 对原核表达载体的构建应注意事项  39
    4.2.2 原核载体在E.coli 中的诱导表达应注意事项  39-40
    4.2.3 对于重叠延伸PCR 的应用  40
    4.2.4 关于病毒样品的保存应注意  40
    4.2.5 对于荧光显微镜的观察应注意  40
    4.2.6 稀有密码子的预测  40
    4.2.7 根据蛋白理化性质预测结果应注意  40-41
    4.2.8 对于抗体制备的方法  41
    4.2.9 试剂配制时应注意  41-42
参考文献  42-47
英文缩略表  47-48
附表  48-49
致谢  49-50
作者简介  50
硕士期间发表论文  50

大麦黄矮病毒PAV株系CP与GFP融合基因构建和原核表达及其抗血清制备

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