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橙色大白菜原生质体的制备及BcpLHRNAi载体的遗传转化

作　者: 武云霞
导　师: 张鲁刚
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 蔬菜学
关键词: BCPLH 遗传转化 橙色大白菜 子叶 下胚轴 原生质体
分类号: S634.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 27次
引　用: 1次
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内容摘要


以西北农林科技大学蔬菜花卉研究所白菜课题组提供的橙色大白莱(Brassica campestris syn. rapa L. ssp.pekinensis (Lour) Olsson)优良品种金冠2号为试材,就其子叶及下胚轴原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了研究。以橙色大白菜06J28材料,进行BcpLH RNAi载体的遗传转化,就其预培养时间、菌液浓度、菌液浸染时间、共培养时间,选择压等进行了研究。取得如下结果:1.建立了适宜橙色大白菜金冠2号子叶原生质体游离的条件,即为CPW + DPD培养基+ 0.8%纤维素酶R-10 + 0.1%离析酶R-10 + 0.5 mol/L甘露醇+ 10mM CaCl2.2H2O + 0.7Mm KH2PO4 + 0.1% MES,酶解温度为26±1℃,酶解时间2h,产量达3.52×106个/g.FW,活力60.3 %。2.建立了适宜金冠2号下胚轴原生质体游离的条件,即为CPW + DPD培养基+ 1.5%纤维素酶R-10 + 0.3%离析酶R-10 + 0.5mol/L甘露醇+ 10mMCaCl2·2H2O + 0.7Mm KH2PO4 + 0.1% MES,酶解时间18 h,产量达2.20×106个/g.FW,活力63.7%。3.建立了适宜橙色大白菜金冠2号子叶和下胚轴原生质体纯化的条件,即为21 %蔗糖,800 r/min等密度梯度法离心5min纯化原生质体效果最佳。4.获得了橙色大白菜06J28转BcpLH RNAi的植株。06J 28材料的无菌苗的带柄子叶,预培养2d后,用培养至OD600约0.5的转化农杆菌菌液侵染5 min,共培养2 d后,转入含7 mg/L PPT + 500 mg/L Cef培养基上,直至长出芽;待芽长至2～3 cm时剪下,转入培养基1/2 MS + 5 mg/L PPT + 500 mg/L Cef上诱导生根,将具有除草剂PPT抗性的苗移栽,培育得到43个抗性植株,经PCR检测有1株再生植株含有目的片段。5.转BcpLH RNAi的植株与对照06J28的植株在幼苗期和结球前期表型上有明显区别。幼苗期时,叶柄比对照更长、叶色偏黄、叶面光泽强、表皮毛减少,叶长椭圆型,无裂刻,株型半直立,其最显著的区别是叶片向上卷曲,形同“瓢状”。结球前期转化大白菜叶片出现明显皱缩,叶片向上卷曲。说明结球大白菜所表现出来的叶片卷曲现象可能和BcpLH基因的表达有关。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章 文献综述  10-26
  1.1 引言  10-11
  1.2 大白菜原生质体的游离、纯化  11-20
    1.2.1 原生质体研究进展  11-14
    1.2.2 影响因素  14-20
  1.3 大白菜遗传转化体系  20-24
    1.3.1 BcpLH 基因的研究进展  20-21
    1.3.2 主要转化途径  21-24
  1.4 问题与展望  24-25
  1.5 本研究的目的及意义  25-26
第二章 橙色大白菜原生质体的游离和纯化  26-35
  2.1 材料与方法  26-28
    2.1.1 材料  26
    2.1.2 试剂  26
    2.1.3 方法  26-27
    2.1.4 试验设计  27-28
  2.2 结果与分析  28-33
    2.2.1 酶的浓度对原生质体产量和活力的影响  28-29
    2.2.2 不同苗龄对原生质体产量和活力的影响  29-30
    2.2.3 酶解时间对原生质体产量和活力的影响  30
    2.2.4 渗透压对原生质体产量和活力的影响  30-32
    2.2.5 离心对原生质体产量和活力的影响  32-33
  2.3 讨论  33-35
第三章 BCPLH RNAI 对大白菜的遗传转化  35-43
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 材料  35
    3.1.2 方法  35-37
  3.2 结果与分析  37-41
    3.2.1 各试验因子对遗传转化体系的影响  37-40
    3.2.2 转化植株的PCR 检测  40
    3.2.3 转基因大白菜的表型观察  40-41
  3.3 讨论  41-43
第四章 结论  43-44
参考文献  44-52
主要缩略语表  52-53
致谢  53-54
作者简介  54

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 白菜类 > 大白菜
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