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利用RNAi技术进行中国野生葡萄SBP转录因子功能研究

作　者: 侯鸿敏
导　师: 王西平
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: RNAi 中国野葡萄 SBP转录因子拟南芥基因功能
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

葡萄白粉病(Uncinula necator)是严重危害欧洲葡萄的真菌病害之一。本课题组采用mRNA差异显示和RACE技术(mRNA differential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)获得了中国野生葡萄华东葡萄(V. pseudoreticulata)白河-35-1在白粉病病原菌侵染后诱导表达的SBP(SQUAMOSA promoter binding protein, SBP)转录因子cDNA。本研究就是通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA序列进行分析,根据其保守区、非保守区设计引物,分别构建以保守区和非保守区为目的基因的RNAi植物表达载体,通过花序浸润法转化拟南芥,初步了解SBP家族基因的功能。获得以下主要结果:1.分别构建了中国野生葡萄SBP转录因子cDNA保守区和非保守区的RNAi植物表达载体。通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA进行结构分析,预测基因保守和非保守区域。根据其保守和非保守区序列以及pENTRTMTOPO vector要求设计合成两对特异引物:SBPb-F5’CAC CGC AGG TTT GAC TCC CCT TCA CAT AG 3’, SBPb-R5’AGA GCC ACA CAT ACG CAG ACA GC 3’, SBPf-F5’CAC CGA AAA ATG CAA GCC AAG TAT CAA 3’, SBPf-R5’TCT CAA GAG GAG TTC CAC CAT AG 3’,并进行PCR扩增,将获得的目的片段定向连接到pENTRTM/D-Topo载体,经过PCR检测和测序分析得到正确入门克隆载体后,分别与目的载体pHellsgate8进行LR反应,利用PCR扩增和XHoI、XBaI单酶切检测鉴定,获得SBP转录因子保守区和非保守区的RNAi植物表达载体pHellsgate8-SBPb和pHellsgate8-SBPf。2.获得了具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株。通过农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,在含卡那霉素40mg/L的MS培养基中对T0代转化植株的种子进行抗性筛选,获得了48株pHellsgate8-SBPb转基因拟南芥和63株pHellsgate8-SBPf转基因拟南芥。分别提取T1代转基因拟南芥的DNA,经PCR检测初步证明目的基因已导入拟南芥。3.中国野生葡萄SBP转录因子功能分析。将野生拟南芥和转基因拟南芥转入基质中生长两个月后,对获得的抗性植株表型进行观察,在pHellsgate8-SBPb的转基因植株中发现一株不抽薹不开花的转基因突变体植株。与野生型拟南芥相比,其叶色浓绿且叶缘缺刻明显,营养生长旺盛,而其他抗性植株与野生型拟南芥相比,表现出生长势较弱,抽薹分枝数和角果数都较少。初步证明中国野生葡萄SBP转录因子可能与植株抽薹开花有关。

利用RNAi技术进行中国野生葡萄SBP转录因子功能研究

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