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家蚕蜕皮触发激素及其受体基因的克隆和表达分析

作　者: 舒旭
导　师: 夏庆友
学　校: 西南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 BmETH BmETHR 基因结构 表达特征
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 8次
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内容摘要


蜕皮是昆虫个体生长所必需的生命过程,是昆虫变态发育的重要过程之一。从形态学角度米说,昆虫蜕皮过程包括旧表皮的脱离和新表皮的形成;从分子生物学角度来看,昆虫蜕皮是多种激素协调调控的结果。尽管已经清楚昆虫蜕皮主要是由保幼激素和蜕皮激素协同控制,但是由于蜕皮的过程相当复杂,蜕皮相关信号通路及关键调节基因仍有待深入研究。家蚕是重要的鳞翅目模式昆虫,其生命周期要经过卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段,是研究昆虫蜕皮发育的理想模式之一。在果蝇和烟草天蛾等昆虫蜕皮的激素调控研究中,研究者发现了一个参与蜕皮促发的激素基因,即蜕皮触发激素(Ecdysis triggering hormone,ETH)。基于家蚕基因组数据库,我们对家蚕ETH基因及其受体ETHR进行了克隆和表达分析,期望为阐释家蚕蜕皮的激素调控机制提供更多的数据支撑。通过生物信息学分析,我们在家蚕基因组精细图预测基因中鉴定获得了与烟草天蛾ETH及其受体ETHR的同源基因,命名为BmETH和BmETHR。根据家蚕预测基因序列设计引物,分别克隆获得了这两个基因的完整ORF序列。其中,BmETH基因ORF全长为303bp,由2个内含子和3个外显子构成,编码100个氨基酸,预测分子量大小为11.49kD,等电点是7.51。SignalP在线信号肽预测发现,BmETH编码的第1到15个氨基酸为信号肽。BmETHR基因ORF全长为810bp,BmETHR基因不含内含子,编码269个氨基酸,预测分子量大小为31.07kD,等电点是9.91蛋白质序列比对分析表明,BmETHR基因与其它昆虫ETHR基因具有保守的跨膜结构域。采用RT-PCR技术,我们分析了BmETH基因和BmETHR基因在胚胎期、幼虫期、变态期以及在幼虫5龄3天各个组织中的表达情况。结果表明,BmETH在家蚕胚胎发育初期不表达,在胚胎发育后期的表达逐渐升高。在幼虫发育过程中,BmETH基因几乎都是在每个龄期蜕皮前上调表达;在变态发育过程中,BmETH在吐丝前、化蛹前和化蛾前上调表达。BmETH的时期表达特征暗示其与胚胎形态发生及幼虫或蛹期蜕皮紧密相关。在幼虫5龄3天各组织中,BmETH基因仅在气管、丝腺、精巢和中肠等组织中高量表达,这与其他昆虫中ETH基因仅在气管中高量表达的特征有些差异。在不同发育阶段,BmETHR的表达一般随BmETH的表达量变化发生一定程度的变化,提示其与ETH的信号传导相关;但是,BmETHR在胚胎发育早期也有表达,而在幼虫5龄3天的丝腺和中肠组织中低量表达,与ETH的表达并无相关性,暗示其可能不受ETH的调节。另外,我们利用在家蚕中已建立的原位杂交技术,对家蚕BmETH基因在气管中的表达进行了组织定位,结果表明家蚕BmETH基因在气管附着的气门上腺中的Inka细胞中表达。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章 文献综述  11-21
  1.1 概述  11
  1.2 昆虫蜕皮的激素调控机理  11-13
    1.2.1 昆虫蜕皮的激素调控网络  11-12
    1.2.2 参与昆虫蜕皮的主要激素  12-13
  1.3 蜕皮触发激素  13-16
    1.3.1 Inka细胞与蜕皮触发激素  13-14
    1.3.2 气门上腺的发育变化  14-15
    1.3.3 蜕皮触发激素作用于中枢神经机制  15-16
  1.4 家蚕蜕皮机理的研究进展  16-21
    1.4.1 蜕皮激素对家蚕蜕皮的作用机理  16-18
    1.4.2 蜕皮激素与保幼激素的协调作用  18
    1.4.3 蜕皮激素对家蚕体壁的作用  18
    1.4.4 蜕皮激素对蚕蛹及蚕蛾的作用  18-21
第二章 引言  21-23
  2.1 研究背景  21
  2.2 研究目的和意义  21-22
  2.3 研究技术路线  22-23
第三章 家蚕BmETH基因及BmETHR基因克隆  23-39
  3.1 材料与方法  23-28
    3.1.1 实验材料  23-24
    3.1.2 基因克隆  24-27
    3.1.3 生物信息学分析  27-28
  3.2 结果与分析  28-37
    3.2.1 家蚕BmETH和BmETHR基因的基因组鉴定  28
    3.2.2 家蚕BmETH和BmETHR基因的cDNA克隆  28-29
    3.2.3 BmETH和BmETHR基因的cDNA克隆的测序  29-31
    3.2.4 家蚕BmETH基因的序列分析  31-33
    3.2.5 家蚕BmETHR基因的序列分析  33-37
  3.3 讨论  37-39
第四章 家蚕BmETH和BmETHR基因的表达分析  39-53
  4.1 材料与方法  39-46
    4.1.1 RT-PCR分析  39
    4.1.2 BmETH基因的组织原位杂交  39-46
  4.2 结果与分析  46-52
    4.2.1 家蚕BmETH基因及其受体BmETHR基因的时空表达特征  46-48
    4.2.2 家蚕BmETH基因的组织定位分析  48-52
  4.3 讨论  52-53
第五章 结论  53-55
参考文献  55-59
发表论文及参与课题一览表  59-61
致谢  61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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