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进口水产品中单增李斯特菌的监测与风险分析

作　者: 梁启平
导　师: 方维焕；黄绍棠
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物与食品安全
关键词: 单增李斯特菌进口水产品血清型4b 多位点序列分析毒力
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是重要的人兽共患食源性病原菌,可分为3个谱系(Lineage)与13个血清型,其中谱系Ⅰ包括1／2b、3b、4ab、4b、4d、4e和7型,谱系Ⅱ包括1／2a、1／2c、3a和3c型,谱系Ⅲ包括4a和4c型。单增李斯特菌具备抵抗各种应激(高盐、低pH、氧化应激等)的能力,主要通过污染食品或饲料感染人和动物。针对宁波口岸在2007年7月至2008年11月从北美洲、南美洲、欧洲以及亚洲共29个国家进口的1275批水产品,进行单增李斯特菌鉴定、谱系与血清型分析、小鼠毒力试验与多位点序列分析。单增李斯特菌在8个国家共计33个批次中检出,污染率为2.6%；其中智利的16个批次中,单增李斯特菌污染率高达31.3%；阿根廷／乌拉圭与美国次之,分别为11.5%与11.1%；越南、印度、秘鲁与墨西哥分别为5.9%、1.8%、1.8%与1.0%；而其余21个国家均未检出。在检出的33株单增李斯特菌中,选择23株代表不同国家与时间段(即批次不相连)的菌株进行分析。其中19个菌株(82.6%)属于谱系Ⅰ,4个菌株(17.4%)属于谱系Ⅱ,无谱系Ⅲ菌株。在谱系Ⅰ菌株中,4b型占78.9%[15／19,占总菌株的65.2%(15／23)]；而1／2b型占总菌株的17.4%(4／23)。在谱系Ⅱ菌株中,1／2a型与1／2c型各占总菌株的13.0%(3／23)与4.4%(1／23)。这些分离株对小鼠均具有与强毒参考株相当的毒力。选择毒力基因actA、看家基因ribC与应激调控基因sigB,对23个分离株及9个参考株进行了分析,其中hisJ含有比例最高的多态性位点,达15.2%; ribC次之,为15.0%；而actA与sigB分别为10.7%与5.6%。但actA却可分辨出最多的序列型(Sequence Type, ST),为19个；hisJ、ribC与sigB可分别分辨出16、11与7个序列型。actA的分辨力亦为最强,达0.95；hisJ为0.90；而sigB与ribC分辨力较弱,仅为0.80与0.77。将4个基因串联后,多态性位点比例为11.81%,可分辨出23个序列型,分辨力达0.97。在这些分离株中,来自阿根廷鱿鱼的N1、N14、N15与N16同为序列型8,来自智利鱿鱼的N6、N7与N8同为序列型10,而来自美国三文鱼的N4、来自智利鱿鱼的N13与来自秘鲁鱿鱼的N23同为序列型9。这3个主要序列型均分布于谱系Ⅰ的进化枝上。谱系Ⅰ共22个菌株(含参考株,下同),分为15个序列型；而谱系Ⅱ的7个菌株可分为5个序列型,谱系Ⅲ的3个菌株可分为3个序列型。其中17个4b型菌株形成10个序列型,而5个1／2b型菌株、5个1／2a型菌株、2个4a型菌株均各成一型,表明4b型菌株具有较高的同质性。研究结果表明,进口水产品中单增李斯特菌污染率与国内水产品相近,但部分南美国家的水产品中的检出率特别高,血清型分布以4b型为主,且有流行性克隆Ⅰ检出。因此,对进口水产品中李斯特菌污染的潜在危险性不容忽视,特别是要加强对单增李斯特菌检出率较高的部分南美国家水产品的监测。

全文目录

目录  3-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-10
第一部分文献综述  10-41
  第一章单增李斯特菌流行病学及分子生物学特性  11-22
    1. 流行病学  12-14
      1.1 病原生态学  12-13
      1.2 流行特点  13-14
        1.2.1 传播途径  13
        1.2.2 易感动物及临床表现  13
        1.2.3 易感动物及人类李斯特菌病发病情况  13-14
    2. 分子生物学特性  14-19
      2.1 全基因组  14-15
      2.2 毒力因子  15-19
        2.2.1 内化素A与内化素B(Internalin A and Internalin B)  15-16
        2.2.2 溶血素(LLO)  16
        2.2.3 磷脂酶(PLC)  16-17
        2.2.4 肌动蛋白聚合蛋白(ActA)  17-18
        2.2.5 调控蛋白(PrfA)  18-19
    参考文献  19-22
  第二章单增李斯特菌的检测与分型技术  22-35
    1. 检测技术  22-25
      1.1 传统检测方法  22-23
      1.2 免疫学检测方法  23
      1.3 分子检测方法  23-24
        1.3.1 核酸探针  23-24
        1.3.2 PCR检测方法  24
      1.4 免疫-PCR检测技术  24-25
    2. 分型技术  25-30
      2.1 传统表型分析法  25-26
        2.1.1 血清分型(serotyping)  25
        2.1.2 噬菌体分型(phagetyping)  25
        2.1.3 多区带酶电泳分型(MLEE)  25-26
      2.2 分子分型  26-30
        2.2.1 RAPD分型  26
        2.2.2 AFLP  26-27
        2.2.3 SSCP  27
        2.2.4 MLST  27
        2.2.5 核糖体分型  27-28
        2.2.6 PFGE  28-30
    参考文献  30-35
  第三章水产品进口与食品安全性分析  35-41
    1. 国内水产品进口状况  35-36
    2. 水产品进口的安全性检测  36
    3. 进口水产品安全性分析现状  36-39
    参考文献  39-41
第二部分研究内容  41-63
  第四章进口水产品中单增李斯特菌的监测  42-53
    摘要  42-43
    1 材料与方法  43-47
      1.1 菌株与试剂  43
      1.2 样品的存放与制备  43
      1.3 增菌培养  43
      1.4 VIDAS快速筛选  43-44
      1.5 选择性培养基的分离培养  44
      1.6 鉴定  44-47
    2 结果  47-51
      2.1 表型鉴定结果  47-48
      2.2 PCR鉴定结果  48
      2.3 进口水产品中李斯特菌污染情况  48-51
    3 讨论  51-52
    参考文献  52-53
  第五章进口水产品中单增李斯菌的致病性与风险分析  53-63
    摘要  53-54
    1 材料与方法  54-57
      1.1 菌株及培养基  54-55
      1.2 主要试剂  55
      1.3 引物设计与合成  55
      1.4 基因组DNA的提取  55
      1.5 PCR及其产物测序  55-56
      1.6 谱系分析  56
      1.7 分子血清分析  56
      1.8 小鼠毒力试验  56
      1.9 多位点序列分析与系统进化树构建  56-57
    2 结果  57-58
      2.1 进口水产品中单增李斯特菌的谱系与血清型分布  57
      2.2 ICR小鼠体内毒力试验  57
      2.3 多位点序列分析  57-58
    3 讨论  58-61
    参考文献  61-63
发表论文  63-64
致谢  64

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