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抗Ⅳ型胶原酶单链抗体对博莱霉素诱发的小鼠肺纤维化的抑制作用

作　者: 赖日阳
导　师: 江敏；甄永苏；苗庆芳；李毅
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: Ⅳ型胶原酶单链抗体肺纤维化博莱霉素巨噬细胞
分类号: R563.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肺纤维化是一种慢性、弥散性肺间质病变,表现为进行性肺上皮损伤、胶原堆积、肺间质纤维化和肺通气功能障碍。目前针对肺纤维化的传统治疗均缺少明确的依据且不能改善病人生存率或阻止病程进展。细胞外基质(ECM)的合成与降解平衡被破坏后引起气道异常。基质金属蛋白酶(MMPs)是调节细胞外基质降解的一组重要蛋白酶,对肺纤维化的形成有重要作用。Ⅳ型胶原酶也称为明胶酶(gelatinase),包括MMP-2和MMP-9,在小鼠肺纤维化过程中起重要作用。在肺纤维化病变早期,Ⅳ型胶原酶参与组织损伤和细胞外基质(ECM)的降解,在晚期Ⅳ型胶原酶的表达水平下降,同时其体内天然抑制物TIMP增加,促进了胶原的堆积。本实验室在前期工作中构建了抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11),该抗体不仅能够与Ⅳ型胶原酶结合并抑制其活性,还能抑制肿瘤细胞的体外侵袭。抗体药物具有特异性和靶向性,用抗MMPs的抗体干预肿纤维化的研究在国内外文献中尚未见有报道。本研究利用博莱霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化模型,探讨早期阻断肺纤维化发生或发展的策略,研究scFv(3G11)对小鼠肺纤维化的预防或治疗作用。抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)由工程菌发酵、纯化得到。以ELISA和免疫细胞化学荧光染色法检测抗体的免疫活性,明胶酶谱法检测药物对Ⅳ型胶原酶活性的抑制作用。通过气管内注射博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型,腹腔注射scFv(3G11)进行治疗。小鼠肺组织HE染色石蜡切片观察肺形态变化,以羟脯氨酸含量评价肺胶原沉积。研究结果显示,经scFv(3G11)治疗处理后,30 mg/kg和45 mg/kg剂量组的羟脯氨酸增加值与BLM组相比分别下降45.3%和52.7%。肺病理切片显示纤维化程度降低。病理图像分析表明,治疗组与BLM组相比,有核细胞数减少,肺泡隔所占面积显著减少。免疫荧光细胞化学染色结果显示,scFv(3G11)能与巨噬细胞结合并抑制其分泌的Ⅳ型胶原酶活性。因此得出结论,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体能抑制Ⅳ型胶原酶的活性,并能抑制博莱霉素诱发的肺纤维化。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略语表  7-9
前言  9-11
1 实验材料  11-13
  1.1 质粒和菌株  11
  1.2 动物  11
  1.3 试剂  11
  1.4 培养基  11-12
  1.5 主要仪器  12-13
2 实验方法  13-23
  2.1 单链抗体蛋白的制备及活性检测  13-18
  2.2 抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与巨噬细胞的免疫结合活性  18-19
  2.3 明胶酶谱法测定单链抗体对巨噬细胞分泌的明胶酶活性的影响  19
  2.4 小鼠肺纤维化模型构建  19-20
  2.5 体内观察抗Ⅳ型胶原酶单链抗体对肺纤维化的影响  20-23
3 实验结果  23-34
  3.1 不同转化克隆表达外源蛋白的产量分析  23
  3.2 表达产物的纯化及复性  23-26
  3.3 抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与巨噬细胞的免疫结合活性  26
  3.4 scFv(3G11)对腹腔巨噬细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的抑制作用  26
  3.5 小鼠肺纤维化模型构建  26-28
  3.6 抗Ⅳ型胶原酶单链抗体对肺纤维化的治疗作用  28
  3.7 不同治疗时程的效果比较  28-31
  3.8 支气管肺泡腔盥洗液总蛋白含量  31
  3.9 小鼠体重的变化  31-34
讨论  34-35
结论  35-36
参考文献  36-39
文献综述  39-57
  参考文献  52-57
致谢  57

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体对博莱霉素诱发的小鼠肺纤维化的抑制作用

内容摘要

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