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香蕉枯萎病致病机理初步研究

作　者: 陈石
导　师: 杨国顺；易干军
学　校: 湖南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 香蕉枯萎病绿色荧光蛋白侵染过程 fga1基因白僵菌素
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

香(大)蕉是世界上最重要的水果之一,但是香蕉产业目前正受到香蕉枯萎病的严重威胁。香蕉枯萎病属于土传维管束病害,病菌蔓延快,到目前为止该病菌还没有效的防控方法。因此本研究以分离纯化的病原菌为材料,从侵染过程、致病基因和毒素成分这三方面研究香蕉枯萎病菌的致病机理,为制定切实可行的防病措施提供理论依据。主要研究结果如下：1.以番禺、中山、湛江和三亚等17个地方采集发病香蕉样本为材料,分离到11个4号生理小种菌株(简称：Foc4),6个1号生理小种菌株(简称：Foc1)。2.以番禺分离到的Foc4采用聚乙二醇介导法将绿色荧光蛋白(GFP)转化进病原菌,转化的病原菌在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下清楚可见,转化菌株培养6代后GFP的表达都非常稳定,荧光信号在菌丝和孢子中均清晰可见,转化菌株的致病性和生长方式都没有改变。香蕉枯萎病菌和香蕉苗的互作情况如下：i.小型分生孢子和菌丝均可侵染宿主；ii.侵染的位点包括根毛、幼嫩的根尖及侧根基部的自然开裂,但不包括人为的伤口和木质化程度较高的一级侧根等；iii.在根系组织内部,小型分生孢子可以萌发成芽管或直接溶解细胞壁,菌丝可以直接穿透根表角质层,也可以直接溶解细胞壁,在细胞内外生长；iv.观察到了侵染结构,如菌丝的锥形结构、侵染垫等；v.观察到了孢子和菌丝在根系、球茎、假茎等中的繁殖、累积及相应病症的发展进程。根据研究所得结果,制定出一个快速、高效香蕉抗性评价方法,评价了中国香蕉种质资源圃收集的一些抗性资源。3.利用同源克隆的方法,分离到一个重要的致病基因fgal,比较分析了不同地域Foc1和Foc4病原菌样品中该基因gDNA和cDNA序列的差异。比较结果显示：来自海南的Foc1和Foc4的gDNA长度1286bp,相似性为100%;不同来源Foc1中.fgal基因保守性很强,包含4个外显子和3个内含子,编码一个含有353个氨基酸的蛋白；而对于Foc4,所研究材料中80%的fgal基因有两个转录本,小转录本与Foc1的fgal是一致的,而大转录本由于可变性剪切使得第三个内含子成为外显子,预测编码一个含有372个氨基酸的多肽。4.对Foc1和Foc4所产毒素进行纯化,并利用ESIMS谱和~1H-NMR谱分析毒素成分,首次发现了Foc1和Foc4菌株都能产生白僵菌素。根据ESIMS谱推测Foc1和Foc4菌株都能分泌镰刀菌酸,而且Foc1的镰刀菌酸含量高于Foc4。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
第一章文献综述  10-17
  1.1 香蕉产业概述  10
  1.2 香蕉枯萎病菌的研究概况  10-11
  1.3 尖孢镰刀菌致病机理研究进展  11-15
    1.3.1 尖孢镰刀菌和寄主的互作关系  12-13
      1.3.1.1 侵入前期  12
      1.3.1.2 侵染过程  12-13
    1.3.2 尖孢镰刀菌致病毒素  13-14
    1.3.3 尖孢镰刀菌致病相关基因  14-15
  1.4 香蕉抗枯萎病机制  15-16
  1.5 研究的目的意义  16-17
第二章香蕉枯萎病菌的分离纯化和生理小种的鉴定  17-20
  2.1 试验材料  17
    2.1.1 香蕉材料  17
    2.1.2 主要培养基  17
  2.2 试验方法  17
    2.2.1 病原菌的分离纯化  17
    2.2.2 生理小种的鉴定  17
  2.3 结果与分析  17-19
    2.3.1 香蕉枯萎病症状诊断  17-18
    2.3.2 病原菌的形态特性  18-19
    2.3.3 生理小种的鉴定  19
  2.4 结论和讨论  19-20
第三章利用GFP标记研究香蕉枯萎病菌侵染香蕉的过程及评价香蕉品种抗性  20-38
  3.1 试验材料  20-21
    3.1.1 香蕉材料  20
    3.1.2 培养基和主要试剂  20-21
    3.1.3 菌株和质粒  21
  3.2 试验方法  21-22
    3.2.1 菌株对潮霉素B(HMB)的敏感性测定  21
    3.2.2 真菌转化方法  21-22
    3.2.3 PCR方法鉴定转化菌株  22
    3.2.4 土壤接种  22
    3.2.5 显微镜观察  22
  3.3 结果与分析  22-35
    3.3.1 受体菌株对潮霉素的敏感性  22-23
    3.3.2 转化子对潮霉素的抗性  23-24
    3.3.3 PCR法鉴定转化菌株  24-25
    3.3.4 转化菌株荧光稳定性  25
    3.3.5 侵染位点  25-27
    3.3.6 病原菌在香蕉根组织里面的侵染模式  27-34
    3.3.7 FOC4早期侵染广粉1号香蕉的过程  34
    3.3.8 不同抗性香蕉种质资源对FOC4的反应  34-35
  3.4 结论和讨论  35-38
    3.4.1 香蕉枯萎病菌的侵染规律  35-36
    3.4.2 抗病机理的类型(组成型或诱导型)  36
    3.4.3 早期筛选香蕉抗病品种  36-38
第四章香蕉枯萎病菌FGA1基因的克隆及其多样性研究  38-46
  4.1 材料与方法  38-39
    4.1.1 材料  38
    4.1.2 方法  38-39
      4.1.2.1 病原菌培养  38
      4.1.2.2 香蕉枯萎病菌FGA1的GDNA和CDNA序列的克隆  38
      4.1.2.3 生物信息学分析和引物设计  38-39
  4.2 结果与分析  39-44
    4.2.1 香蕉枯萎病菌FGA1基因的克隆  39
    4.2.2 香蕉枯萎病菌FGA1基因序列分析  39-41
    4.2.3 fgal 基因的cDNA序列的多态性分析  41-44
  4.3 结论和讨论  44-46
第五章香蕉枯萎病菌所产毒素的研究  46-54
  5.1 试验材料  46
    5.1.1 菌株材料  46
    5.1.2 产毒培养基  46
    5.1.3 主要试剂  46
  5.2 试验方法  46-54
    5.2.1 孢子悬液的制备  46
    5.2.2 培养方法  46-47
    5.2.3 毒素提取和纯化  47
    5.2.4 毒素的结构鉴定  47-54
第六章结论及创新之处  54-56
  6.1 结论  54
  6.2 创新点  54-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
个人简历  63

香蕉枯萎病致病机理初步研究

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