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鸭A-FABP基因cDNA克隆与基因多态性的研究

作　者: 张聪聪
导　师: 卢立志；石放雄
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 肌内脂肪含量 A-FABP RACE SSCP RT-PCR
分类号: S834
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

沉积在肌肉内的脂肪是影响肉质和风味的一项重要经济性状。肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)被认为与肉质及口感呈正相关,影响肉质的多汁性、嫩度及风味。脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein,FABP)基因在动物体内脂肪代谢过程中的作用,与肌内脂肪含量等肉质性状显著相关,其中A-FABP (Adipocyte fatty acid bingding protein,A-FABP)和H-FABP (Muscle and heart fatty acid binding protein,H-FABP)已被证实是这些数量性状的候选基因,进行了重点研究。目前家禽育种工作已经取得了很大进展,然而高强度选择又带来了许多负面影响。其中控制脂肪在鸭体内的过多蓄积,提高鸭胴体质量和适口性是中国养禽业急需解决的问题。本研究把A-FABP基因作为鸭肌内脂肪含量的候选基因加以研究,旨在通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆并分析鸭A-FABP基因的结构与功能,利用聚合酶链式反应-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术分析鸭A-FABP基因的单核苷酸多态性,以阐明鸭A-FABP基因的遗传变异,继而以此为分子遗传标记进行辅助选择应用于鸭的育种,对降低鸭体脂、提高鸭肌内脂肪含量和改善鸭肉品质具有重要意义。为揭示鸭A-FABP基因的结构和功能,应用RACE技术首次克隆并鉴定了鸭A-FABP基因cDNA序列。首先用一对含高度保守的DNA片段的兼并引物,从鸭腹部脂肪组织总RNA扩增部分A-FABP片段,经验证与已知序列一致；接着测序并设计新引物分别从5’和3’RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,经SEQMAN软件拼接5’RACE产物和3’RACE产物以及已知序列获得片段大小为652bp的cDNA序列。与鸡A-FABP基因进行BLAST比对分析,结果表明该652bp的cDNA序列由5’-UTR区、CDS区和3’-UTR区组成,其中CDS区长度为399bp,5’非编码区长度为64bp,3’非编码区长度为189bp。包含完整的1、2、3、4外显子序列,与鸡A-FABP基因序列4个外显子一样也分别编码24,58,34和16个氨基酸。鸭A-FABP基因399bp的开放阅读框编码132个氨基酸,推导和分析氨基酸序列表明,分子结构与鸡A-FABP相似,其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。利用DNAMAN软件比较核苷酸序列,与猪、鸡和鹅的A-FABP基因分别有78%、95%和98%的同源性。根据RACE获得鸭A-FABP基因的cDNA序列,设计引物P0,扩增出该基因的第二内含子序列,在此基础上又设计3对引物利用PCR-SSCP方法对获得的序列进行多态性研究。结果引物P1在北京鸭、缙云麻鸭等品种中发现4处单碱基突变,分别为：386处“A-T”突变：388处的“T-C”突变；403处的“T-C”突变；444处的“C-T”突变。这些点突变共产生了3种基因型,且基因型在各鸭品种间的分布有显著差异。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-12
上篇文献综述  12-36
  第一章脂肪酸结合蛋白研究进展  12-20
    1.脂肪酸结合蛋白的功能  12-16
      1.1 脂肪酸结合蛋白与长链脂肪酸的亲和力  12-13
      1.2 脂肪酸结合蛋白运输长链脂肪酸的功能  13-14
      1.3 脂肪酸结合蛋白调节脂肪代谢的功能  14-16
    2.脂肪酸结合蛋白的结构  16-17
    3.脂肪酸结合蛋白基因的演化、染色体定位和结构  17-18
    4.脂肪酸结合蛋白基因表达的调控机制  18-19
    5.脂肪酸结合蛋白基因的多态性  19-20
  第二章肌内脂肪候选基因的研究进展  20-30
    1.肌内脂肪的研究  20-25
      1.1 肌肉组织与肉质  20-23
      1.2 肌内脂肪  23-24
      1.3 肌内脂肪酸  24-25
    2.肌内脂肪候选基因的确定  25-26
      2.1 肌内脂肪主效基因(MI)的统计定位  25-26
      2.2 肌内脂肪的候选基因  26
    3 猪脂肪酸结合蛋白基因遗传变异的研究  26-30
      3.1 猪A-FABP基因、H-FABP基因的基因结构分析  27-28
      3.2 猪A-FABP基因、H-FABP基因的遗传变异和IMF含量的相关分析  28-30
  第三章脂肪酸结合蛋白基因多态性研究进展  30-36
    1 心脏型脂肪酸结合蛋白及其基因  30-31
      1.1 心脏型脂肪酸结合蛋白的表达及功能  30-31
      1.2 心脏型脂肪酸结合蛋白基因定位和结构特点  31
    2 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白及其基因  31-34
      2.1 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的表达及功能  31-32
      2.2 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因定位和结构特点  32-33
      2.3 脂肪酸结合蛋白基因对肌内脂肪含量的影响  33-34
    3 A-FABP基因多态性与肌内脂肪含量等脂肪性状的关联研究  34-36
下篇试验研究  36-74
  第四章鸭A-FABP基因的3′RACE和5′RACE  36-54
    1 材料与方法  37-43
      1.1 试验材料  37
      1.2 试验方法  37-43
    2 结果与分析  43-47
      2.1 斑嘴鸭腹部脂肪组织Total RNA处理  43-44
      2.2 已知序列验证  44
      2.3 3′RACE和5′RACE获得鸭A-FABP基因cDNA序列  44-47
    3 讨论  47-54
      3.1 cDNA末端快速扩增技术是基因克隆的重要内容  47-48
      3.2 cDNA末端快速扩增技术的原理及方法  48-49
      3.3 cDNA末端快速扩增技术的优化和改良  49-54
  第五章鸭A-FABP基因的克隆和序列多态性分析  54-74
    1.材料与方法  55-58
      1.1 试验鸭种来源及采样  55
      1.2 试验方法  55-56
      1.3 统计分析方法  56-58
    2 结果与分析  58-67
      2.1 鸭A-FABP基因的末端快速克隆及序列分析  58-60
      2.2 鸭A-FABP基因cDNA序列的生物信息学分析  60-62
      2.3 PCR-SSCP检测鸭A-FABP基因多态性  62-67
    3 讨论  67-74
      3.1 利用cDNA快速末端扩增技术获得鸭A-FABP基因未知序列  67-68
      3.2 鸭A-FABP基因多态性位点与不同鸭品种及其生产性能的关系  68-69
      3.3 PCR-SSCP技术与鸭A-FABP基因多态性的研究  69-74
参考文献  74-85
结论  85-86
附录  86-87
致谢  87

鸭A-FABP基因cDNA克隆与基因多态性的研究

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