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落新妇三萜酸E体外抗肿瘤活性及其作用机理研究

作　者: 张一斌
导　师: 孙红祥
学　校: 浙江大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 落新妇抗肿瘤落新妇三萜酸E HeLa细胞细胞凋亡细胞周期 Bcl-2 Bax 线粒体跨膜电位 Caspase激活活性氧
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

落新妇为虎耳草科Saxifragaceae植物落新妇Astilbe chinese (Maxim.) Franch.et Sav.的干燥根茎,具有祛风、清热、止咳等功效,民间主要用于风热感冒、头身疼痛、发热咳嗽。浙江富阳民间用落新妇(民间称为“黑芨”)治疗各类癌症,是各种已知抗癌中草药中作用较好的一种。体内外药理学研究结果表明其确实具有抗肿瘤作用。为了进一步阐明落新妇治疗肿瘤的物质基础,从天然药物中寻找高效、低毒、结构新颖的抗肿瘤活性成分,本课题在本实验室前期研究的基础上,对落新妇的化学成分进行了进一步的研究,从其石油醚萃取部分分离得到了一个新的五环三萜类化合物,采用化学方法和多种现代光谱技术确定其化学结构为3β,6β-二羟基乌苏-12-烯-27-羧酸(3β,6β-dihydroxyurs-12-en-27-oic acid),命名为落新妇三萜酸E (astilbotriterpenic acid E, ATE),并采用细胞培养技术和细胞凋亡研究方法研究了其体外抗肿瘤作用及其分子作用机理。1.落新妇三萜酸E的提取分离及结构鉴定落新妇根茎乙醇提取物的石油醚萃取部分,经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及HPLC分离纯化,得到了一个新的五环三萜类化合物,经化学方法及ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC和HMBC等现代波谱技术分析检测,确定其化学结构为3β,6β-二羟基乌苏-12-烯-27-羧酸(3β,6β-dihydroxyurs-12-en-27-oic acid),命名为落新妇三萜酸E (astilbotriterpenic acid E, ATE)。2.落新妇三萜酸E体外抗肿瘤及凋亡诱导作用采用MTT法测定了ATE对人乳腺癌Bcap37细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人肝癌HepG2细胞、人卵巢癌H0-8910细胞、人白血病K562细胞、人肺腺癌PAA细胞、人胃癌SGC7901细胞和小鼠白血病P388细胞等8株细胞增殖的抑制率及半数抑制浓度(IC50)。结果表明：ATE对这8株肿瘤细胞均显示了较强的体外抑制作用,尤其对K562细胞和P388细胞2株白血病细胞的作用更为显著。为了进一步研究ATE抑制肿瘤细胞增殖的时效和量效关系,本实验以台盼蓝拒染法测定ATE对HeLa细胞生长曲线的影响,结果显示ATE呈浓度和时间依赖性抑制肿瘤细胞增殖。MTT法测定ATE对小鼠脾淋巴细胞毒性结果显示：ATE对小鼠脾淋巴细胞亦显示一定的细胞毒性,但其IC50值较对肿瘤细胞的IC50值大,说明ATE对正常细胞的毒性相对较小。不同浓度的ATE处理的Hela细胞经PI和吖啶橙双染后,在荧光显微镜下观察,对照组细胞核DNA显黄绿色均匀荧光,而ATE处理各组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光,甚至可见浓染的黄绿色碎片,呈现典型的细胞凋亡形态学变化,ATE高浓度处理组(25μg/ml)出现一些坏死细胞,在荧光显微镜下呈现红色荧光。ATE浓度为25μg/ml时可诱导Hela细胞DNA降解,在琼脂糖凝胶电泳上呈特征性“梯状”条带。流式细胞仪检测结果表明,Hela细胞经25μg/ml ATE作用24h后呈现凋亡现象,在DNA直方图上显示典型的亚二倍体峰(sub-Gl,即凋亡峰),凋亡率为21.71%,而正常细胞对照组的凋亡率仅为0.87%。上述结果表明ATE能诱导HeLa细胞凋亡。3.落新妇三萜酸E体外诱导HeLa细胞凋亡的分子机理研究流式细胞术检测结果显示：Hela细胞经ATE(10、15、20μg/ml)处理24h后,其G0/G1期细胞百分比随着ATE浓度的增加而显著上升,而S期和G2/M期细胞百分比则下降,说明ATE能将Hela细胞阻滞于G0/G1期。HeLa细胞经不同浓度ATE处理24h后,采用半定量RT-PCR方法检测Bcl-2及Bax基因表达的变化。结果显示：与对照组相比,ATE处理后Bcl-2基因表达水平显著降低,而Bax基因表达水平显著升高,Bcl-2和Bax的比值显著降低。经PI/Rh123双染色,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(ΔΨm)结果显示：ATE能显著降低HeLa细胞的ΔΨm,并呈浓度依赖性。MTT法测定Caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk对ATE处理HeLa细胞存活率的影响,结果表明：z-VAD-fmk可显著提高经ATE(2.5、5、10、15、20μg/ml)处理48h HeLa细胞的存活率,说明Caspase参与了ATE诱导的HeLa细胞凋亡过程。进一步以Western-blot方法检测HeLa细胞经不同浓度的ATE处理24h后Caspase-3、8、9的改变,结果显示：不同浓度的ATE处理后,相对分子量为32KD的Caspase-3蛋白酶原、相对分子量为55KD的Caspase-8蛋白酶原和相对分子量为46KD的Caspase-9蛋白酶原的含量浓度依赖性降低。通过荧光分光光度法检测和荧光显微镜观察发现,ATE可以显著地诱导HeLa细胞产生ROS,并呈现一定的时间和浓度依赖性。HeLa细胞经25μg/ml的ATE处理后,其细胞内活性氧水平逐渐升高,在8h时达到高峰,之后又逐渐下降。综上所述,落新妇三萜酸E(ATE)对多种肿瘤细胞都有显著的增殖抑制作用；能使HeLa细胞阻滞于G0/G1期；并可通过下调HeLa细胞Bcl-2基因表达,上调Bax基因表达,降低线粒体跨膜电位,活化caspase-3、8和9,以及刺激HeLa细胞产生ROS,从而诱导HeLa细胞凋亡。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章乌苏酸的抗肿瘤作用研究进展  13-28
第二章落新妇三萜酸E的分离提取及结构鉴定  28-36
  1.植物来源  29
  2.仪器与试剂  29
  3.提取分离  29-30
  4.结构鉴定  30-36
第三章落新妇三萜酸E体外抗肿瘤及凋亡诱导作用  36-46
  1.材料与仪器  36-38
  2.实验方法  38-40
    2.1 体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用  38-39
    2.2 对正常细胞的毒性研究  39
    2.3 体外对HeLa细胞的凋亡诱导作用  39-40
  3.试验结果  40-44
    3.1 对各肿瘤细胞的增殖抑制作用  40-41
    3.2 对HeLa细胞生长的影响  41-42
    3.3 对小鼠脾细胞的毒性  42
    3.4 荧光染色形态学观察  42
    3.5 DNA琼脂糖凝胶电泳  42-44
    3.6 对Hela细胞凋亡率的影响  44
  4.讨论  44-46
第四章落新妇三萜酸E体外诱导HeLa细胞凋亡的分子机理研究  46-66
  1.材料与仪器  47-48
  2.实验方法  48-54
    2.1 对HeLa细胞周期的影响  48-49
    2.2 半定量RT-PCR测定对HeLa细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响  49-51
    2.3 对HeLa细胞线粒体跨膜电位的影响  51
    2.4 z-VAD-fmk对落新妇三萜酸E处理组HeLa细胞存活率的影响  51
    2.5 Western-blot方法检测对HeLa细胞Caspase-3、8和9的影响  51-53
    2.6 对HeLa细胞产生ROS的影响  53-54
  3.实验结果  54-61
    3.1 对Hela细胞周期的影响  54-56
    3.2 对HeLa细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响  56
    3.3 对HeLa细胞跨膜电位的影响  56-58
    3.4 z-VAD-fmk对落新妇三萜酸E处理组HeLa细胞存活率的影响  58
    3.5 对HeLa细胞Caspase-3、8、9的影响  58-59
    3.6 落新妇三萜酸E不同处理时间对HeLa细胞产生ROS的影响  59-60
    3.7 落新妇三萜酸E不同处理浓度对HeLa细胞产生ROS的影响  60-61
  4.讨论  61-66
结论  66-67
参考文献  67-74
主要缩略词  74-75
常用试剂及配制  75-78
致谢  78

落新妇三萜酸E体外抗肿瘤活性及其作用机理研究

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