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鸡X期胚盘细胞的冷冻保存及复苏后嵌合体鸡制备的研究

作　者: 邓缘
导　师: 洪亚辉；燕海峰
学　校: 湖南农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 鸡囊胚细胞慢速冷冻玻璃化冷冻种蛋开窗嵌合体
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究以黑丝毛乌骨鸡X期囊胚细胞(BCs)为实验材料,采用DMSO(二甲基亚枫)、EG〔乙二醇)、蔗糖和DMEM等冷冻保护剂组成的6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液,经慢速冷冻程序和玻璃化冷冻程序进行超低温冷冻保存。液氮中冻存2周解冻后,以复苏的BCs为供体,白来航鸡为受体,通过赤道面开窗法制作了白来航鸡-丝毛乌骨鸡的嵌合体。并对种蛋开窗技术对孵化率的影响进行了分析。旨在探讨X期BCs的冷冻保存和BCs嵌合体批量制作技术,为禽类遗传资源多样性的保存开辟新途径。其研究结果如下：1.黑丝毛乌鸡X期BCs冷冻复苏后的存活率：BCs在慢速冷冻保护液配方Ⅰ保护下复苏细胞的活率最高(72.13%),与慢速冷冻保护液配方Ⅵ保护下复苏细胞的活率(64.48%)之间差异显著(P<0.05),并与其他慢速冷冻保护液配方保护下复苏细胞的活率差异不显著(P>0.05)。BCs在玻璃化冷冻保护液配方Ⅱ保护下复苏细胞的活率最高(71.32%),与其他冷冻保护液配方保护下复苏细胞的有极显著性差异(P<0.01)。同时,慢速冷冻保护液最好配方(配方Ⅰ)保护下复苏细胞的活率(72.3%)与玻璃化冷冻保护液最好配方(配方Ⅱ)保护下复苏细胞的活率(71.32%)之间无显著性差异(P>0.05),表明就复苏后BCs细胞活率而言,慢速冷冻保存法和玻璃化冷冻保存法对鸡BCs都有很好的保护效应。2.种蛋开窗技术(专利号：200710034253)对孵化率影响的研究：本文所采用种蛋赤道面开窗不同封口方式对孵化率影响的差异不显著，但综合评价以膜+胶的效果最好(孵化率最高为65%)。种蛋开窗后添加液体或去除空气泡对孵化率无显著影响。3.X期囊胚细胞复苏后嵌合体鸡的制作：以黑丝毛乌鸡冷冻复苏后的BCs为供体,辐照处理后的白来航鸡种蛋为受体,赤道面开窗后,用微注射方法将供体细胞直接注射入同期受体胚盘的囊胚腔下制作的嵌合体。总计孵化210枚种蛋(对照70枚),孵化出壳121只活雏(对照组56只),实验组平均孵化成活率46.4%；22只嵌合体活雏(未冷冻组12只,冷冻组10只),未冷冻组嵌合率为17.1%,冷冻组嵌合率为14.3%,两组嵌合率无显著性差异(P>0.05)。4.嵌合体鸡的检测：经嵌合体种系传递检测,嵌合体♂×乌骨鸡早的测交组合,其中4只嵌合体公鸡中有2号、5号、8号12号能分别产生比率为2.2%(2/90)、2.9%(8/272)和5.4%(12/220)的黑羽特征(羽色嵌合体模型意义上的种系嵌合体)后代。而且2号还得到了1.8%(5/272)的有“十全”特征(羽色和羽形嵌合体模型意义上的种系嵌合体)后代。嵌合体早(12号)×乌骨鸡♂的测交组合中,获得黑羽、纯乌骨鸡特征率分别为31.3%(30/96)、8.3%(8/96)。对试验鸡进行PCR检测,有嵌合体表型鸡均有体细胞嵌合,没有嵌合体表型的试验鸡中有62.5%(5/8)的鸡存在体细胞嵌合现象。作为传统的禽类遗传物质保存形式的拓展,BCs冷冻及复苏后嵌合体制作方法的建立,为禽类遗传资源多样性的保存开辟了一条新途径,同时也可为BCs的体外遗传操作提供细胞来源。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章文献综述  11-25
  1 鸡X期胚盘细胞和胚胎发育的影响因素  11-12
    1.1 X期胚盘细胞的特点  11
    1.2 鸡胚发育的影响因素  11-12
  2 胚胎细胞超低温冷冻保存的研究  12-17
    2.1 超低温冷冻保存对细胞冷冻损伤的机理  12-13
    2.2 影响细胞超低温保存效果的因素  13-15
    2.3 细胞超低温冷冻的保存方法  15
    2.4 细胞超低温冷冻保存的意义  15-16
    2.5 超低温冷冻保存的研究进展  16-17
  3 嵌合体鸡的研究  17-23
    3.1 利用BCs细胞制作嵌合体鸡  17-18
    3.2 利用PGCs细胞制作嵌合体鸡  18-20
    3.3 提高嵌合体嵌合程度的方法  20-21
    3.4 嵌合体的检测方法  21-23
  4 本研究的目的与意义  23-25
第二章实验部分  25-51
  实验一鸡BCs细胞冷冻保存技术的研究  25-36
    1.1 实验材料  25
      1.1.1 家鸡种蛋来源  25
      1.1.2 主要试剂  25
      1.1.3 主要仪器  25
    1.2 实验方法  25-29
      1.2.1 鸡BCs细胞的分离  25-26
      1.2.2 鸡BCs细胞的活率检测  26
      1.2.3 鸡BCs细胞的冷冻保存与复苏  26-28
      1.2.4 复苏后BCs细胞的活率检测  28
      1.2.5 复苏后BCs细胞培养及形态学鉴定  28-29
      1.2.6 数据处理  29
    1.3 结果与分析  29-30
      1.3.1 复苏后BCs细胞的存活率  29-30
      1.3.2 复苏后BCs细胞的鉴定  30
    1.4 讨论  30-36
      1.4.1 冷冻前囊胚细胞的处理  30-31
      1.4.2 慢速冷冻和玻璃化冷冻的保存原理  31
      1.4.3 冷冻保护剂降低BCs细胞存活率的原因  31-32
      1.4.4 冷冻程序对BCs细胞存活率的影响  32-34
      1.4.5 复苏程序对BCs细胞存活率的影响  34-35
      1.4.6 复苏的BCs细胞生物学特性及冷冻方法效果比较  35-36
  实验二 BCs细胞冷冻复苏后嵌合体鸡的制备  36-51
    2.1 实验材料  36-37
      2.1.1 供体和受体  36
      2.1.2 主要试剂  36
      2.1.3 主要仪器  36-37
      2.1.4 显微注射工具的制作  37
    2.2 实验方法  37-40
      2.2.1 不同种蛋开窗对孵化率的影响  37-38
      2.2.2 供体(丝羽乌骨鸡)BCs细胞的复苏  38
      2.2.3 受体种蛋的辐射致弱  38
      2.2.4 家鸡嵌合体的制作  38
      2.2.5 嵌合体种蛋的孵化  38-39
      2.2.6 嵌合体检测  39-40
      2.2.7 数据处理  40
    2.3 结果与分析  40-47
      2.3.1 种蛋开窗及封口对鸡胚发育的影响  40-43
      2.3.2 嵌合体实验鸡胚的发育与嵌合率统计  43-44
      2.3.3 嵌合体鸡的生长发育和测交实验  44-46
      2.3.4 嵌合体鸡的PCR检测结果  46-47
    2.4 讨论  47-51
      2.4.1 影响嵌合体孵化率的因素  47-48
      2.4.2 嵌合体制作方法的探讨  48-50
      2.4.3 种系嵌合体细胞遗传的初探  50-51
第三章结论  51-52
参考文献  52-60
附图  60-64
致谢  64-65
作者简介  65

鸡X期胚盘细胞的冷冻保存及复苏后嵌合体鸡制备的研究

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