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牛新孢子虫亚单位疫苗的研究

作　者: 高建伟
导　师: 鲁承
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新孢子虫 亚单位疫苗 体液免疫 细胞免疫 保护率
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 43次
引　用: 1次
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内容摘要


新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于犬、牛、马、羊等多种宿主动物细胞内而引起的一种原虫病。新孢子虫病是多种家畜共患的一种原虫病,该病对牛的危害尤为严重。目前,还没有防制新孢子虫病的有效措施,一般认为疫苗免疫是预防牛流产和降低经济损失的可行性措施,因此,开发新疫苗已成为该领域研究热点。本试验通过体外培养新孢子虫,并采用液氮-水浴反复冻融及超声波裂解虫体,经葡聚糖凝胶层析分离纯化出多种可溶性抗原,将分离纯化的可溶性抗原经SDS-PAGE分析蛋白分子量大约为43KDa、36KDa和33KDa,分别与新孢子虫两种表面抗原和一种致密颗粒抗原相对应,经Western-blotting分析,所分离的抗原蛋白均具有反应原性。将纯化蛋白浓缩合并分别辅以Cp-M、IMS1313和Polygen三种佐剂及PBS免疫沙鼠,测定沙鼠的体液免疫和细胞免疫应答,以评价疫苗的免疫效果。应用IFAT对免疫后沙鼠每周抗体效价进行测定,结果显示,三个佐剂组的抗体效价均高于PBS组,其中Cp-M组效价最高,从二免后第二周起PBS组与三个佐剂组抗体效价均差异极显著(P＜0.01),最高抗体效价可达1:1600,攻毒后,各组抗体效价均显著上升,Cp-M组最高可达1:3 200。免疫沙鼠的细胞免疫测定分别采用检测T淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+百分含量及淋巴细胞转化试验进行评估。结果显示,疫苗Cp-M组、IMS1313组、Polygen组和PBS组的CD4~+细胞含量均高于对照组,Cp-M组、IMS1313组和Polygen组与对照组均差异极显著(P＜0.01)。四种疫苗组的CD8~+细胞含量均高于对照组,Cp-M组、IMS1313组与对照组差异极显著(P＜0.01),四种疫苗组的CD4~+/CD8~+值均高于对照组,Cp-M组与对照组差异极显著(P＜0.01)。疫苗Cp-M组淋巴细胞转化率明显高于对照组,差异显著(P＜0.05)。攻毒试验后经计算得出疫苗保护率分别为,Cp-M组75%,IMS1313组62.5%,Polygen组50%,PBS组50%。本试验的结果显示新孢子虫亚单位疫苗可以激活体液免疫和细胞免疫反应,具有一定的保护作用,并可为新孢子虫新型疫苗的研制提供参考。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-12
前言  12-28
  1 新孢子虫病概述  12-16
    1.1 病原体  12
    1.2 分类地位  12-13
    1.3 形态结构  13-14
    1.4 生活史  14-15
    1.5 牛感染新孢子虫病的临床症状  15
    1.6 病理变化  15-16
  2 病原学诊断  16-17
    2.1 超微结构检查  16
    2.2 病理组织学检查  16
    2.3 虫体分离和体外培养  16-17
    2.4 免疫组织化学检查(IHC)  17
    2.5 动物接种试验  17
  3 血清学诊断  17-20
    3.1 间接荧光抗体试验  18-19
    3.2 酶联免疫吸附试验  19
    3.3 凝集试验(AT)  19
    3.4 聚合酶链式反应(PCR)  19-20
  4 新孢子虫病流行情况  20-21
  5 免疫学研究  21-24
    5.1 抗原  21-23
    5.2 免疫机制  23-24
  6 实验动物模型  24-25
  7 新孢子虫疫苗研究  25-27
    7.1 弱毒苗与灭活苗  25-26
    7.2 核酸疫苗  26-27
    7.3 亚单位疫苗  27
  8 本研究的目的及意义  27-28
材料与方法  28-39
  1 材料  28-33
    1.1 新孢子虫体外培养所用材料  28
    1.2 血清  28
    1.3 试验动物  28
    1.4 免疫佐剂  28
    1.5 SDS-PAGE所用溶液  28-29
    1.6 Western-blotting所用溶液  29-30
    1.7 检验用培养基  30-31
    1.8 间接荧光抗体试验所需材料  31-32
    1.9 沙鼠脾细胞悬液制备所需材料  32-33
    1.10 主要仪器  33
  2 方法  33-39
    2.1 新孢子虫的体外培养  33-34
    2.2 新孢子虫可溶性抗原的提纯及分析  34-35
    2.3 亚单位疫苗的制备  35-36
    2.4 疫苗检测试验  36
    2.5 疫苗免疫效果试验  36-38
    2.6 沙鼠攻毒试验  38
    2.7 应用组织PCR法检测沙鼠新孢子虫人工感染  38
    2.8 数据统计  38-39
结果  39-49
  1 新孢子虫的体外培养  39
  2 新孢子虫可溶性抗原的纯化  39-40
  3 新孢子虫可溶性抗原SDS-PAGE分析  40
  4 新孢子虫可溶性抗原免疫印迹分析  40-41
  5 无菌试验结果  41
  6 安全性试验结果  41-42
  7 间接荧光抗体试验结果  42-43
    7.1 新孢子虫标准阳性血清和FITC-羊抗鼠IgG(H+L)浓度的确定  42
    7.2 荧光抗体检测结果  42-43
  8 免疫沙鼠血清特异性抗体的动态变化  43-45
  9 细胞免疫测定结果  45-47
    9.1 淋巴细胞转化率测定结果  45
    9.2 沙鼠T淋巴细胞亚群含量的测定结果  45-47
  10 疫苗保护率测定结果  47-48
  11 PCR检测结果  48-49
讨论  49-53
结论  53-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
作者简介  63

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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