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人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)属乳多空病毒科,是一类特异感染人皮肤和粘膜的双链闭合环状DNA病毒,具有种属特异性,不能在培养基中生长,主要感染人体表皮细胞或黏膜上皮,引起感染部位发生病变。目前已分离出100多型HPV,分为低危型和高危型。低危型主要有6,11,34,44型等,与粘膜上皮的良性肿瘤有关,主要导致乳头状瘤,尖锐湿疣,低度子宫上皮内瘤变等,高危型有16,18,31,33,35,39型等,与宫颈癌密切相关, 90%以上的宫颈癌组织中可以检测到HPV,其中HPV16所占比例最高检测率超过50%,所以,在疫苗研发中主要针对HPVl6的研究,对宫颈癌的预防及治疗具有十分重要的意义。HPV基因分为3部分,早期基因(E区)、晚期基因(L区)、无编码的长控制区(Long Control region,LCR)。E区有6个开放性阅读框架(El、E2、E4、E5、E6、E7),其中高危HPV的E6、E7编码蛋白是使正常细胞恶变的主要转化蛋白,共同促进病毒复制,使感染细胞持续性增生,并使肿瘤抑制基因失效,HPV E6与抑癌基因p53作用,使其失去在细胞周期中的DNA纠错功能,HPV E7则抑制pRb,进而激活诱导促进细胞周期持续循环的基因,使其组织持续增生, E6、E7基因在宫颈癌持续发展中起重要作用。研制安全、有效、经济的HPV疫苗,对于防治宫颈癌具有十分重要的意义。本研究成功构建了以HPV16E6E7基因重组质粒pcDNA-E6E7,免疫小鼠,评价HPV16E6E7基因疫苗的免疫效应。方法:酶切重组质粒pGEM-T-E6E7,将E6E7基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HPV16E6E7基因重组质粒pcDNA-E6E7,经限制性内切酶和序列检测鉴定后转染COS-7细胞,通过IFA法验证HPV16E6E7能在体外培养的真核细胞中暂态表达。将构建成功的重组质粒经大量制备和纯化后,以聚乙烯胺(polyethylenimine,PEI)为佐剂包裹,肌肉注射6周龄BABL/c小鼠,同时设原载体pcDNA3.1(-)和生理盐水为对照组,每隔2周注射一次,共注射3次,在最后一次免疫后两周在小鼠眼底静脉采血,分离血清,IFA法分析基因免疫在小鼠体内诱导的体液免疫应答和细胞免疫应答。结果构建的HPV16E6E7基因重组质粒pcDNA-E6E7,能在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠的血清中可检测到抗E7抗体,而原载体pcDNA3.1(-)和生理盐水注射后,未检测出特异的抗E7抗体;通过ELISA定量检测细胞因子IL-2和IFNγ分泌情况,实验组产生的IL-2明显高于对照组与空白组,P<0.01;实验组产生的IFNγ明显高于对照组与空白组,P<0.05各组间差异具有统计学意义。实验结果表明构建的HPV16E6E7基因疫苗能够在体外培养的细胞中暂态表达,免疫小鼠后通过IFA法和ELISA定量检测分析该疫苗株可诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。本文通过HPV 16E6E7的基因疫苗的基础研究为HPV感染性疾病相关性疫苗的研制提供了实验平台,为HPV的治疗寻找一种有效的方法,为HPV16 E6E7基因疫苗的开发做了有益的尝试。因此本研究工作将为下一步利用基因疫苗治疗HPV感染性疾病的临床前期研究打下了基础,同时本研究结果在控制HPV感染性疾病方面将会有潜在的应用价值。
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