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火焰卫矛组织培养再生体系优化及遗传转化研究

作　者: 祖庆学
导　师: 赵德刚
学　校: 贵州大学
专　业: 植物学
关键词: 火焰卫矛 再生 组织培养 农杆菌 遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


火焰卫矛（Euonymus alatus ’compacta’）属于卫矛科落叶灌木,因其叶片里火焰红色而具有重要的园艺观赏和经济价值,每株成熟的火焰卫矛每年能生产成百上千粒种子。由于通过鸟类和流水的传播,火焰卫矛在美国非常流行,甚至不可控制,破坏其他植物区系,严重威胁生态平衡。本研究以火焰卫矛为研究对象,优化了植株组织培养再生体系,并在此基础上探索农杆菌介导火焰卫矛遗传转化技术,为利用基因工程技术对火焰卫矛进行遗传改良打下了基础。主要研究结果如下:（1）火焰卫矛植株组培再生体系优化本研究以火焰卫矛成熟胚培养长出的子叶、下胚轴为外植体进行组织培养及植株再生研究,优化了火焰卫矛组织培养再生体系。研究结果表明:成熟胚培养基为WPM+TDZ0.5mg·L-1;愈伤组织诱导培养基为WPM+6-BA6 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1;不定芽分化培养基为WPM+6-BA6 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1;不定芽增殖和壮苗培养基为WPM+6-BA4 mg·L-1;生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg·L-1+AC0.5 g·L-1。移栽基质为营养土,成活率为83.3%。（2）农杆菌介导火焰卫矛遗传转化体系建立以火焰卫矛子叶和下胚轴为转化受体进行遗传转化体系研究,确定了子叶和下胚轴不定芽分化的有效卡那霉素（kan）筛选压分别为60 mg·L-1和50 mg·L-1;而在抑菌剂头孢霉素（cef）和特美汀（Timentin）浓度对比研究中发现,Timentin对不定芽分化的影响要小于头孢霉素（Cef）的影响,Timentin浓度为400 mg·L-1时,子叶分化率达到23.89%,而Cef在相同浓度下子叶分化率仅为15.56%;并确定Timentin最佳抑菌浓度为200 mg·L-1。探讨了遗传转化过程中外植体预培养时间、共培养时间、浸染菌液浓度和浸染时间对遗传转化效率的影响。结果表明,外植体预培养2 d,共培养3d,菌液浓度OD600为0.4～0.5,浸染6 min为最佳技术参数;在YEP液体培养基中添加100μmol·L-1AS可提高转化率8.8%。（3）转基因植株筛选鉴定通过农杆菌介导法遗传转化火焰卫矛,并对转化植株进行GUS组织活性及PCR检测,证明由Barnase和iaaM组成的超级不育表达元件已经整合到火焰卫矛植株,从78株抗性植株中筛选出转基因植株3株。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
第一章 文献综述  10-26
  1 木本观赏植物组织培养研究进展  10-14
    1.1 木本观赏植物离体培养研究现状  10-11
    1.2 木本观赏植物组织培养的应用  11-12
      1.2.1 离体快速繁殖  11
      1.2.2 单倍体育种  11
      1.2.3 原生质体培养和体细胞杂交  11
      1.2.4 体细胞无性系变异及突变体筛选  11-12
      1.2.5 植物的遗传转化  12
    1.3 影响木本观赏植物组织培养的因素  12-14
      1.3.1 培养基成分  12-13
      1.3.2 外植体的选择  13
      1.3.3 其它影响因素  13-14
  2 木本观赏植物基因工程研究进展  14-17
    2.1 木本观赏植物遗传转化特点  14
    2.2 木本观赏植物遗传转化方法  14-16
      2.2.1 叶盘法  14-15
      2.2.2 整体植株共感染法  15
      2.2.3 原生质体法  15
      2.2.4 体细胞或胚细胞的转化法  15
      2.2.5 真空渗入法  15-16
    2.3 木本观赏植物遗传转化的影响因素  16-17
      2.3.1 Vir基因的活化对遗传转化的影响  16
      2.3.2 外植体预培养对遗传转化的影响  16
      2.3.3 外植体共培养对遗传转化的影响  16
      2.3.4 选择压、抑菌剂对遗传转化的影响  16
      2.3.5 其他因素对遗传转化的影响  16-17
  3 植物雄性不育基因工程研究进展  17-21
    3.1 利用基因工程创造雄性不育植株的主要策略  17-19
      3.1.1 特异表达细胞毒素基因创造雄性不育系  17-18
      3.1.2 利用反义RNA技术获得植物雄性不育  18
      3.1.3 通过提早降解胼胝质获得植物雄性不育系  18-19
        3.1.4 细菌基因在植物中组成型表达导致植物雄性不育  19
        3.1.5 其他策略  19
    3.2 Barnase基因与雄性不育  19
    3.3 基因工程创建雄性不育系的恢复系  19-21
      3.3.1 利用雄性不育基因的反义基因  19
      3.3.2 利用引起雄性不育基因的抑制基因来恢复育性  19-20
      3.3.3 通过化学调控恢复育性  20
      3.3.4 利用定位重组系统来恢复不育植株的育性  20-21
    3.4 基因工程雄性不育系的保持  21
  4 植物单性结实研究进展  21-24
    4.1 人工诱导植物单性结实的策略  22-23
      4.1.1 采用无活力或不亲合的花粉授粉诱导单性结实  22
      4.1.2 外源激素处理诱导单性结实  22
      4.1.3 射线处理诱导单性结实  22-23
      4.1.4 通过三倍体获得单性结实果实  23
    4.2 植物单性结实基因工程研究进展  23-24
      4.2.1 iaaM基因在单性结实基因工程中的应用  23-24
      4.2.2 iaaM基因在其他基因工程中的应用  24
  5 火焰卫矛研究进展  24-25
    5.1 形态特征和生物学特性  24
    5.2 火焰卫矛资源利用现状  24-25
  6 本论文研究的目的与意义  25-26
第二章 火焰卫矛组织培养再生体系的建立  26-41
  1 材料与方法  26-28
    1.1 材料  26
    1.2 方法  26-28
      1.2.1 材料的预处理  26-27
        1.2.1.1 器械准备  26
        1.2.1.2 火焰卫矛无菌材料获得  26-27
        1.2.1.3 不同外植体接种方法  27
      1.2.2 培养基  27
      1.2.3 培养条件  27
      1.2.4 培养过程  27-28
        1.2.4.1 火焰卫矛愈伤组织诱导与不定芽分化  27
        1.2.4.2 壮苗与生根培养  27-28
        1.2.4.3 炼苗移栽  28
  2 结果分析  28-38
    2.1 火焰卫矛无菌材料诱导培养  28-29
      2.1.1 火焰卫矛无菌材料培养最佳消毒时间确定  28-29
      2.1.2 不同培养基对火焰卫矛胚诱导培养的影响  29
    2.2 火焰卫矛子叶愈伤组织和不定芽分化  29-32
      2.2.1 培养基对子叶愈伤组织诱导及芽分化的影响  29-30
      2.2.2 不同激素配比对火焰卫矛子叶愈伤组织诱导的影响  30-31
      2.2.3 不同激素配比对火焰卫矛子叶不定芽分化的影响  31-32
    2.3 火焰卫矛下胚轴愈伤组织和不定芽分化  32-34
      2.3.1 培养基对下胚轴愈伤组织诱导及芽分化的影响  32
      2.3.2 不同激素配比对火焰卫矛下胚轴愈伤组织诱导的影响  32-34
      2.3.3 激素配比对下胚轴不定芽分化的影响  34
    2.4 不同激素浓度对火焰卫矛增殖的影响  34-35
    2.5 不同苗龄对火焰卫矛子叶愈伤组织诱导和分化的影响  35-36
    2.6 不同培养基与激素组合对生根诱导的影响  36-37
    2.7 不同炼苗时间和基质对火焰卫矛移栽的影响  37-38
  3 讨论  38-41
    3.1 材料的消毒与获得  38
    3.2 培养过程对外植体分化的影响  38-39
    3.3 激素种类和浓度对愈伤组织及不定芽诱导的影响  39
    3.4 不同培养基和激素对生根的影响  39-41
第三章 农杆菌介导的火焰卫矛遗传转化研究  41-61
  1 实验材料  42-46
    1.1 植物材料  42
    1.2 农杆菌菌株及质粒  42-43
    1.3 主要生物化学试剂  43
    1.4 主要仪器  43
    1.5 常用培养基  43-44
      1.5.1 细菌培养基  43-44
      1.5.2 植物培养基  44
    1.6 常用溶液  44-46
  2 实验方法  46-50
    2.1 火焰卫矛无菌材料获得  46
    2.2 根癌农杆菌的培养  46
    2.3 遗传转化步骤  46-47
    2.4 卡那霉素(Kan)有效选择压的确定  47
    2.5 遗传转化技术参数比较  47-48
      2.5.1 预培养时间  47
      2.5.2 农杆菌菌液浓度  47
      2.5.3 农杆菌浸染时间  47
      2.5.4 共培养时间  47
      2.5.5 乙酰丁香酮  47-48
      2.5.6 延迟筛选  48
    2.6 不同抑菌剂敏感性研究  48
    2.7 GUS组织化学染色  48
    2.8 转基因植物的PCR检测  48-50
      2.8.1 植物基因组DNA的提取(CTAB法)  48-49
      2.8.2 质粒DNA提取(小量快速抽提)  49
      2.8.3 引物及PCR扩增程序  49-50
  3 结果分析  50-59
    3.1 卡那霉素(Kan)有效选择压的确定  50-51
      3.1.1 卡那霉素(Kan)对火焰卫矛子叶愈伤组织及不定芽分化的影响  50-51
      3.1.2 卡那霉素(Kan)对火焰卫矛下胚轴愈伤组织及不定芽分化的影响  51
    3.2 不同因素对火焰卫矛遗传转化的影响  51-55
      3.2.1 预培养时间对火焰卫矛遗传转化的影响  51-52
      3.2.2 共培养时间对火焰卫矛遗传转化的影响  52
      3.2.3 菌液浓度对火焰卫矛遗传转化的影响  52-53
      3.2.4 浸染时间对火焰卫矛遗传转化的影响  53-54
      3.2.5 乙酰丁香酮(AS)对火焰卫矛遗传转化的影响  54
      3.2.6 延迟筛选对火焰卫矛遗传转化的影响  54-55
    3.3 抑菌剂对子叶和下胚轴不定芽分化的影响  55-57
    3.4 转基因植株的GUS组织染色鉴定  57-58
    3.5 转基因植株PCR分子检测  58-59
  4 讨论  59-61
    4.1 预培养、共培养时间、菌液浓度和OD600值对遗传转化效率的影响  59
    4.2 卡那霉素(Kan)对转化的影响  59-60
    4.3 延迟筛选对遗传转化的影响  60
    4.4 抑菌剂浓度对遗传转化的影响  60-61
参考文献  61-67
致谢  67-68
缩写  68-69
附录  69-71

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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