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Ang-1基因修饰的Nestin阳性骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的实验研究

作　者: 李祥炎
导　师: 徐皓
学　校: 福建医科大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞脊髓损伤血管生成素-1 神经特异性巢蛋白皮层体感诱发电位
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：(1)分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,将其诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过分子生物学技术将Ang-1基因转染入细胞内；(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,评估其可行性；(3)通过Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs局部注射对损伤脊髓进行治疗,检测Nestin阳性的BMSCs是否能够分化为神经元细胞,检测Ang-1对移植入体内的Nestin阳性的BMSCs,新生及损伤后残留的神经元细胞是否具有保护作用。方法：(1)采用全骨髓差速贴壁分离培养法将SD大鼠双后肢股骨、胫骨骨髓内的BMSCs进行分离培养。通过显微镜下观察细胞生长性状；流式细胞仪检测其细胞表面标志物CD29、CD34、CD45和CD90的表达；向成骨样细胞、成脂肪样细胞及成神经样细胞分化证明其具有多向分化潜能；同时将BMSCs诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过腺病毒载体将Ang-1基因转染入Nestin阳性的BMSCs中,Weston blot检测转染后的细胞是否表达Ang-1。(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,造模后1周内通过运动功能评价、神经电生理检测及组织病理学检测等方法检测模型的可行性；(3)造模后1周对随机分组的大鼠实施局部注射移植细胞进行治疗,在随后的1～4周内通过运动功能评价、神经电生理检测及脊髓组织的免疫组织化学检测等方法检测Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs对损伤后脊髓的相关作用。结果：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养的BMSCs增殖速度快,扩增能力强,传代培养3代后细胞可获较高纯度；通过流式细胞仪检测细胞表面标记物,细胞表达CD29和CD90,阳性率均达99%以上；在体外通过诱导分化后细胞可分化为成骨细胞、成脂肪细胞及成神经样细胞；通过Weston blot检测转染后的Nestin阳性BMSCs出现Ang-1条带。(2)造模后1周内,大鼠出现明显截瘫(BBB<4分),经神经电生理检测无法引出CSEP波形,脊髓组织出现大量炎性细胞浸润,脊髓空泡变性。(3)移植后1-4周,A组大鼠后肢神经功能无明显变化,B、C组大鼠均有不同程度的恢复,C组较B组明显(P<0.05)；神经电生理检测,C组亦明显优于B组(P<0.05)；损伤脊髓经免疫组织化学染色后,B、C两组均表达BrdU、Nestin、NSE,随着时间的延长,阳性细胞数逐渐减少,但移植4周后C组仍保持一定量的阳性细胞,且明显多于A、B两组(P<0.05)。C组还可观察到BrdU阳性细胞向血管腔周围聚集。结论：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养法能够获取较高纯度的BMSCs,细胞具有多向分化潜能,经神经诱导后,细胞能分化为Nestin阳性BMSCs,通过分子生物学技术,Ang-1基因转染入Nestin阳性BMSCs中获得成功。(2)成功构建SD大鼠T10脊髓钳夹型损伤模型。(3)经Ang-1基因修饰后的Nestin阳性BMSCs移植入体内后能进一步分化为成熟的神经元细胞,同时其分泌的Ang-1对Nestin阳性的BMSCs、新生及残留神经细胞具有保护作用,对脊髓损伤具有一定的修复作用。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
第一部分 SD大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及Ang-1基因转染Nestin阳性的BMSCs  10-34
  材料与方法  10-19
  结果  19-28
  讨论  28-32
  小结  32-34
第二部分 SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型的制备  34-43
  材料与方法  34-38
  结果  38-41
  讨论  41-42
  小结  42-43
第三部分 Ang-1基因修饰的Nestin阳性骨髓间充质干细胞对脊髓损伤的治疗作用  43-60
  材料与方法  43-47
  结果  47-54
  讨论  54-58
  小结  58-60
全文结论  60-61
参考文献  61-67
英文缩略词表  67-68
致谢  68-69
文献综述血管生成素的相关研究及其在骨科中的应用前景  69-76

Ang-1基因修饰的Nestin阳性骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的实验研究

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