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新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及分离株HN蛋白抗原表位差异性分析

作　者: 董丽
导　师: 刘秀梵
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫单克隆抗体抗原表位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

新城疫(Newcastle Disease, ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的多种禽类发生感染和死亡的一种急性、接触性传染病。从1920年代到现在,NDV已经在世界范围内引起了四次大的流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。新城疫病毒粒子囊膜表面包含两种类型的糖蛋白:血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin -neuraminidase protein, HN)和融合蛋白(fusion protein, F)。HN蛋白与病毒的毒力及致病性密切相关,是主要的保护性抗原,在NDV的研究中具有非常重要的意义。尽管NDV只有一个血清型,但不同亚型的病毒间存在较大的抗原差异。单克隆抗体具有针对单个抗原决定簇的特异性,可以识别不同的抗原位点,因此可以用来检测不同毒株之间抗原的差异性。本文分别用全病毒和真核表达质粒作为免疫原,免疫小鼠后制备了针对HN蛋白不同抗原表位的单抗,然后用单抗对不同时间、不同来源、不同基因型的NDV毒株进行排谱反应,进而分析了不同NDV毒株HN蛋白间的抗原差异。1.全病毒免疫原的纯化以及核酸免疫原的构建JS/05/5/Go毒株接种10日龄SPF鸡胚,37℃孵化以扩增病毒,鸡胚死亡后收集尿囊液,离心纯化后作为免疫原;同时,已有的研究证实HN蛋白的大多数功能位点主要位于球状区,其中包含6个反向平行的β折叠,大部分抗原位点主要位于前400个氨基酸残基,即β1～β3折叠上。因此,根据前3个β折叠在空间上的位置,我们将编码前400位氨基酸的基因序列分为两段,分别连接到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建了重组表达质粒:pcDNA-HN1和pcDNA-HN2。重组质粒转染真核表达细胞后,能够与抗NDV的多抗反应,证明蛋白成功表达并具有活性。2. HN蛋白不同抗原表位单抗的研制将纯化好的病毒和构建好的表达质粒分别免疫BALB/C小鼠后,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性克隆,并采用有限稀释法对其进行亚克隆。以病毒作为免疫原,共筛得10株杂交瘤细胞系,分别为:1B5,1C5,2G7,2G8,3B5,4C11,4H6,5C2,5G8,5G9;以两段核酸为免疫原各筛选出1株杂交瘤细胞系,分别为4H11,2E8。单抗与NDV主要蛋白的作用结果显示:上述单抗均针对病毒的HN蛋白。单抗的研制为新城疫病毒HN蛋白抗原差异性的研究打下了基础。3.单抗在病毒抗原差异性研究上的应用将本研究获得的和实验室冻存的共15株针对HN蛋白的杂交瘤细胞系用辣根过氧化物酶标记后进行竞争ELISA试验,结果显示:15株杂交瘤细胞系分属于10个不同的抗原位点。选取10株代表性的单抗对实验室不同来源、不同时间、不同基因型的30株NDV进行排谱实验,结果显示,其中4株单抗针对的位点比较保守,另外6株单抗所针对的抗原位点在部分毒株中发生了变异。根据单抗与病毒的反应性,可将30株病毒分为6组,每组病毒具有不同的单抗反应谱。单抗与病毒之间的反应差异性表明HN蛋白上的部分抗原表位存在着较明显的变异。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
符号说明  11-13
综述：新城疫病毒HN 蛋白抗原表位研究进展  13-23
  1 新城疫病毒HN 蛋白概述  14-16
  2 新城疫病毒HN 蛋白抗原位点研究进展  16-17
  3 单克隆抗体在NDV 研究中的应用  17-19
    3.1 在病毒抗原差异性研究上的应用  17
    3.2 在临床诊断上的应用  17-18
    3.3 在流行病学研究中的应用  18-19
  参考文献  19-23
第一章新城疫病毒HN 蛋白单克隆抗体的制备  23-44
  1 材料  24-27
    1.1 毒株、鸡胚及鸡抗NDV 多抗血清  24
    1.2 细胞系、实验动物及表达NDV 蛋白的重组鸡痘病毒  24
    1.3 菌种、质粒与细胞  24-25
    1.4 主要试剂  25
    1.5 溶液的配制  25-26
    1.6 主要仪器及耗材  26-27
    1.7 分子生物学软件  27
  2 方法  27-34
    2.1 全病毒及核酸免疫原的制备  27-32
    2.2 单抗的制备  32-34
  3 结果  34-38
    3.1 PCR 产物鉴定  34-35
    3.2 pGEM-T-HN 酶切鉴定结果  35
    3.3 pcDNA-HN 酶切鉴定结果  35-36
    3.4 间接免疫荧光结果  36-37
    3.5 杂交瘤细胞株的建立  37
    3.6 单抗腹水效价测定  37
    3.7 单抗亚类鉴定  37-38
    3.8 单抗与囊膜蛋白的反应性  38
  4 讨论  38-41
  参考文献  41-44
第二章单抗在病毒抗原差异上的应用  44-56
  1 材料  44-45
    1.1 病毒、阳性血清与单抗  44-45
    1.2 主要试剂  45
    1.3 主要仪器设备  45
  2 方法  45-48
    2.1 单抗腹水的纯化  45-46
    2.2 酶标单抗的制备与纯化  46
    2.3 单抗在HN 蛋白上的分区  46-47
    2.4 NDV 毒株单抗排谱实验  47-48
  3 结果  48-51
    3.1 辛酸-硫酸铵法提纯单抗的SDS-PAGE 结果  48
    3.2 酶标单抗的直接ELISA 效价的测定  48-49
    3.3 单抗在HN 蛋白上的分区结果  49-50
    3.4 单抗排谱结果  50-51
  4 讨论  51-54
  参考文献  54-56
致谢  56

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及分离株HN蛋白抗原表位差异性分析

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