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江苏地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及其病原核衣壳蛋白的原核表达

作　者: 王明珍
导　师: 秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp2基因序列分析核衣壳蛋白
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。2006年以来,我国暴发了一种以高热、高发病率、高死亡率为特征的“猪高热综合症”。通过国内学者的大量研究,证实高致病性PRRSV变异株是“猪高热综合症”的主要病因。1. RT-PCR检测方法的建立和PRRSV Nsp2基因序列的分析为了快速鉴别高致病性PRRSV和经典毒株,根据GenBank公布的基因序列,在Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,经典毒株扩增片段为734bp,而高致病性PRRSV扩增片段为644bp,建立了能区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法。利用建立的方法对采集的江苏地区临床病料进行了检测,结果表明临床病料阳性率为40%,且流行毒株都是PRRSV变异株。利用设计的欧洲型PRRSV引物对临床样品检测,未检测到欧洲型PRRSV。对18株PRRSV分离株的Nsp2基因序列分析,结果表明,18株病毒的Nsp2基因扩增大小均为644bp。与美洲型代表毒株VR-2332的氨基酸同源性在57.5%-68.7%,与高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82.2%-97.6%、80.4%-95.3%。且18株病毒的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1相同。2.高致病性PRRSV RD2007的分离和鉴定选取PCR检测阳性样品,组织研磨无菌化处理,离心取上清接种于单层的Marc-145细胞,结果在培养第2代时,细胞出现明显病变,主要表现为细胞聚集、成簇,发生裂解。将细胞悬液进行RT-PCR检测扩增出644bp大小的片段,用抗PRRSV N蛋白单抗做间接免疫荧光检测,结果感染细胞可见绿色荧光。证明本研究分离到一株PRRSV,命名为RD2007。3.高致病性PRRSV RD2007株的全基因组序列分析为了解RD2007株的基因变异情况,通过RT-PCR分段扩增并测定RD2007株的全基因组序列,序列分析结果表明:RD2007株属于美洲型毒株,Nsp2蛋白中存在30个氨基酸的不连续缺失。与经典毒株VR-2332的全基因组核苷酸同源性是89.2%,与国内分离株的JXA1株的基因组核苷酸同源性在99.1%,遗传进化分析表明RD2007与国内高致病性PRRSV亲缘关系较近,有着共同的祖先。4. PRRSV N基因的克隆及原核表达根据GeneBank发表的PRRSV ATCC VR-2332株ORF7基因序列,设计并合成一对引物,利用RT-PCR方法扩增ORF7基因片段。将扩增片段克隆至pGEM-T Easy载体中,构建N基因重组载体pGEM-T-N。将ORF7基因片段再克隆至pET32a表达载体中,通过酶切分析,结果获得阳性表达质粒pET32a-N。然后将pET32a-N质粒转化E.coli BL21感受态细胞,在28℃IPTG0.5mM 5h的条件下获得了PRRSV N蛋白的高效表达。经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得的融合蛋白分子量约为35kDa,与预期大小一致,且融合蛋白为可溶性表达。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
符号说明  9-10
猪繁殖与呼吸综合征研究进展  10-28
研究内容  28-65
  第一章检测PRRSV RT-PCR 方法的建立及Nsp2 序列分析  28-39
    1 材料和方法  29
    2 方法  29-31
    3 结果  31-36
    4 讨论  36-37
    参考文献  37-39
  第二章PRRSV RD2007 毒株的分离与鉴定  39-45
    1 材料  39-40
    2 方法  40-41
    3 结果  41-42
    4 讨论  42-43
    参考文献  43-45
  第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒 RD2007 株的基因组序列测定及分析  45-57
    1 材料  46
    2 方法  46-48
    3 结果  48-54
    4 讨论  54-55
    参考文献  55-57
  第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达  57-65
    1 材料  57-58
    2 方法  58-60
    3 结果  60-63
    4 讨论  63-64
    参考文献  64-65
致谢  65

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