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致病性犬瘟热病毒的分离鉴定及其H基因的序列分析

作　者: 王秀东
导　师: 陈立志
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬瘟热病毒致病性分离鉴定 H基因
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

从吉林某地一犬瘟热疑似发病犬肺脏分离到一株病毒,通过实验室和动物试验鉴定所分离的病毒为犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV-JT1株。2009年吉林某地一犬瘟热疑似发病犬濒临死亡,表现为鼻镜干燥、眼分泌物增多和精神极度沉郁,做安乐死,剖检发现出血性肺炎,无菌采集肺脏,将肺脏组织研磨接种于MDCK细胞,通过连续传代出现典型的合胞体样巨细胞病变(CPE)。电镜观察到CDV-JT1具有副粘病毒的形态特征;理化特性试验表明CDV-JT1的核酸为RNA型,病毒粒子有囊膜,对乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱;直接免疫荧光试验和RT-PCR鉴定CDV-JT1为CDV阳性。动物接种CDV-JT1株后出现典型的犬瘟热症状,表现为体温升高、食欲减退、腹泻血便、口角皮疹、眼鼻出现脓性分泌物和前肢脚掌呈“硬足症”,发病犬于攻毒后第16～18 d内相继死亡;剖检可见攻毒犬肺出血、肺气肿、膀胱内壁出血、肠内壁出血和水肿、气管环状出血、脑膜出血,对照犬正常;病理切片可见攻毒犬肺泡中充满了以中性粒细胞为主的大量炎性细胞、膀胱毛细血管扩张充血和粘膜下水肿。H基因序列分析表明CDV-JT1属于Asia-1型,为中国流行野毒株。致病性犬瘟热病毒CDV-JT1株的分离成功,对开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理研究提供了一定的基础数据。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-21
  1.1 犬瘟热病毒的基因组结构  11
  1.2 犬瘟热病毒的结构蛋白  11-14
    1.2.1 核衣壳蛋白（N）  11-12
    1.2.2 磷蛋白(P)  12
    1.2.3 CDV 的基质膜蛋白(M)  12
    1.2.4 融合蛋白(F)  12-13
    1.2.5 附着或血凝蛋白(H)  13
    1.2.6 大蛋白(L)  13-14
  1.3 犬瘟热的病原学  14
  1.4 宿主范围  14
  1.5 临床表现  14-15
  1.6 发病机制  15
  1.7 组织病理学  15-16
  1.8 犬瘟热病毒免疫学  16-17
  1.9 免疫抑制  17
  1.10 疫苗防制  17-19
  1.11 诊断技术  19-21
    1.11.1 病毒的分离鉴定  19
    1.11.2 包涵体检查法  19-20
    1.11.3 犬瘟热的特异性抗原和抗体检测  20
    1.11.4 分子生物学诊断  20-21
第二章犬瘟热病毒的分离和鉴定  21-36
  2.1 材料  21
    2.1.1 病料来源  21
    2.1.2 细胞、培养基和CDV 参考毒株  21
    2.1.3 主要试剂  21
    2.1.4 主要仪器  21
  2.2 方法  21-25
    2.2.1 病料的采集和处理  21
    2.2.2 细胞培养  21-22
    2.2.3 病毒分离培养  22
    2.2.4 病毒鉴定  22-25
  2.3 结果  25-34
    2.3.1 病毒分离结果  25
    2.3.2 病毒形态观察  25-26
    2.3.3 直接免疫荧光鉴定  26
    2.3.4 RT-PCR 鉴定  26
    2.3.5 毒价测定结果  26-27
    2.3.6 病毒理化特性试验结果  27
    2.3.7 动物回归试验  27-34
  2.4 讨论  34-36
    2.4.1 分离病毒细胞的选择  34
    2.4.2 细胞维持液血清的处理和培养细胞的温度  34
    2.4.3 病毒分离株的细胞病变  34
    2.4.4 病毒分离株实验室常规鉴定  34
    2.4.5 动物回归试验  34-36
第三章犬瘟热病毒H 基因组序列分析  36-51
  3.1 材料和方法  36-38
    3.1.1 主要试剂  36
    3.1.2 克隆载体和受体菌  36
    3.1.3 病毒毒株  36
    3.1.4 引物设计  36
    3.1.5 病毒基因组RNA 的提取  36
    3.1.6 反转录  36
    3.1.7 PCR 反应  36-37
    3.1.8 凝胶电泳  37
    3.1.9 PCR 产物的回收纯化  37
    3.1.10 目的基因与T 载体的连接  37
    3.1.11 转化  37
    3.1.12 质粒的小量制备  37-38
    3.1.13 重组质粒的酶切鉴定  38
    3.1.14 序列测定及分析  38
  3.2 结果  38-50
    3.2.1 目的基因的RT-PCR 扩增结果  38-39
    3.2.2 重组质粒的酶切鉴定结果  39-40
    3.2.3 分离株H 基因测序结果  40-41
    3.2.4 H 基因的同源性分析  41-44
    3.2.5 H 基因的系统进化分析  44-47
    3.2.6 CDV 分离株CDV-JT1 H 基因推导的氨基酸序列比较  47-50
  3.3 讨论  50-51
第四章全文结论  51-52
参考文献  52-59
附录  59-62
致谢  62-63
作者简历  63

致病性犬瘟热病毒的分离鉴定及其H基因的序列分析

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