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两种基因型结核分枝杆菌的比较蛋白组学分析

作　者: 亓英芳
导　师: 刘思国
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛分枝杆菌 结核分枝杆菌 蛋白质组学 双向电泳 质谱
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景:牛结核病不仅对奶牛养殖业造成了巨大的经济损失,而且严重威胁公共卫生安全。近年来出现的人结核病与牛结核病相互传染的情况,给结核病的彻底根除造成了巨大的困难。本实验室从西北一牛场中分离到2株结核分枝杆菌XB07001和XB07002,并利用间隔区寡核苷酸分型技术对其分型,结果XB07001为Haarlem 3家族成员,XB07002属于family33家族。Haarlem 3家族是除了北京家族以外,另一个与结核病流行和耐药性相关的菌株。方法及结果:本研究利用双向电泳结合质谱鉴定的蛋白组学方法,对这两株结核分枝杆菌进行分析。提取不同基因型结核分枝杆菌XB07001和XB07002的全菌体可溶性蛋白,以双向电泳技术对蛋白质进行分离,考马斯亮蓝染色,扫描得到双向电泳图谱,利用软件ImageMaster 2D Platinum 6.0分析差异蛋白,选取26个差异蛋白进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,共有21个蛋白得到成功鉴定,包括XB07001上调表达的17个,XB07002上调表达的4个。XB07001表达上调的17个蛋白分别为:假想蛋白Rv2226、苯醌甲基转移酶、rRNA甲基转移酶、I型限制修饰系统DNA甲基化酶、冷休克盒蛋白A、电子转移黄素蛋白a亚基、假想蛋白MT1685、假想蛋白BCG1806c、假想蛋白MtubE11019、假想蛋白Rv1636、短链脱氢酶、超氧化物歧化酶SOD、丙酮酸脱氢酶、糖基转移酶、假想蛋白TBCG01580、转录调控蛋白和苹果酸脱氢酶。XB07002上调表达的4个蛋白分别为:延伸因子Tu、跨膜转运蛋白MmpL13B、共伴侣素GroES和细胞分裂蛋白Ftsz。差异蛋白功能分别涉及甲基化、能量代谢、分子伴侣和毒力蛋白等。利用PCR方法从基因水平上验证7个差异蛋白,结果与双向电泳的结果部分一致;分别扩增FtsZ、GroES和SOD并构建重组质粒pET32a-FtsZ、pET32a-GroES和pET32a-SOD,重组质粒转化入DE3,经IPTG诱导表达纯化得到重组蛋白,分别免疫新西兰兔,制备了3种蛋白的兔多克隆血清,借助western-blot方法进一步验证这3个蛋白,结果与双向电泳的变化趋势完全一致。这些结果显示蛋白质组学是研究结核分枝杆菌差异蛋白的有效手段,并为结核分枝杆菌的致病性和耐药性研究提供一种新的思路。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章 绪论  13-25
  1.1 牛结核病概况  13-20
    1.1.1 牛结核病的流行状况  13-14
    1.1.2 牛结核病病原学  14-17
    1.1.3 牛结核病诊断方法  17-20
  1.2 蛋白组学概述  20-24
    1.2.1 蛋白质组学的由来  20
    1.2.2 蛋白质组学常用技术  20-21
    1.2.3 双向电泳-质谱技术在结核病中的应用  21-24
  1.3 研究目的和意义  24-25
第二章 双向电泳-质谱分析  25-51
  2.1 材料与方法  25-38
    2.1.1 菌种  25
    2.1.2 主要仪器  25
    2.1.3 试剂  25-26
    2.1.4 试剂配制  26-30
    2.1.5 结核分枝杆菌培养  30
    2.1.6 菌体蛋白的制备  30
    2.1.7 蛋白浓度测定  30-31
    2.1.8 菌体蛋白双向电泳  31-33
    2.1.9 扫描并软件分析  33
    2.1.10 MALDI-TOF-TOF 鉴定差异蛋白  33-34
    2.1.11 基因水平验证差异蛋白  34-35
    2.1.12 Western-blot 验证  35-38
  2.2 结果  38-46
    2.2.1 样品制备及浓度检测结果  38-39
    2.2.2 双向电泳结果  39-40
    2.2.3 差异蛋白质谱鉴定结果  40-42
    2.2.4 差异蛋白的功能分类  42-43
    2.2.5 差异蛋白验证结果  43-46
  2.3 讨论  46-51
    2.3.1 结核分枝杆菌在牛场中的流行  46
    2.3.2 双向电泳样品制备  46-48
    2.3.3 差异蛋白  48-51
第三章 全文结论  51-52
参考文献  52-62
致谢  62-63
作者简历  63

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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