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野生塔里木马鹿粪便DNA提取方法和性别鉴定研究

作　者: 李秦豫
导　师: 马合木提·哈力克
学　校: 新疆大学
专　业: 生物学
关键词: 塔里木马鹿 粪便DNA 粪便保存 SRY 性别鉴定
分类号: Q953
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 70次
引　用: 1次
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内容摘要


塔里木马鹿(cerus elaphus yarkandensis)属于国家Ⅱ级保护动物,鹿科大型兽类,是众多马鹿亚种中分布于荒漠地区的特殊亚种之一,在新疆的生物多样性中占有重要的地位。其分布范围比较狭小,仅分布于塔里木河中下游和车尔臣河下游地区,其种群数目由于环境的不断恶化而不断减小,生存状况令人堪忧。以粪便为材料提取DNA进行野生动物的研究,近年来已经引起了国内外越来越多的关注。但是由于粪便样本有其自身的特殊性,例如含杂质过多,容易降解、DNA量少、个体间存在差异等等,因此常常会导致DNA提取的失败。本试验用非损伤性取样方法,以塔里木马鹿粪便作为研究对象,结合国内外常用的三种粪便DNA提取方法的特点,建立了一种适合塔里木马鹿等大型植食性哺乳动物的粪便DNA提取方法,讨论了影响粪便提取的一些相关因素;并利用SRY引物和一个微卫星引物对提出的粪便DNA进行PCR扩增,以检验DNA的质量和初步鉴定塔里木马鹿野外种群的性别比例。本试验主要得出以下结果:1.以塔里木马鹿粪便为样本,粪便DNA的提取最佳流程如下:采用干燥冷冻保存法保存样本、每个样本做多个平行管、用丙酮或PBS对粪便进行预处理、采用手术刀刮取粪便外部表层、CTAB裂解细胞、SiO2特异吸附DNA、最后合并多管产物并用纯化试剂盒进行纯化,以得到较高质量的DNA;2.从50份粪便样本中,成功扩增了45份样本,其中16份为雄性,29份为雌性。雄雌比率为0.55:1。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章 前言  9-26
  1 塔里木马鹿概况  9-11
  2 塔里木马鹿研究现状  11-12
  3 非损伤性取样方法的选择  12-13
    3.1 毛发的非损伤性取样  12
    3.2 粪便的非损伤性取样  12-13
    3.3 其他样品的非损伤性取样  13
  4 粪便样本的优点  13
  5 粪便DNA 提取的可行性  13-14
  6 粪便的DNA 分子标记  14-15
    6.1 线粒体DNA  14
    6.2 微卫星  14
    6.3 多位点小卫星  14-15
    6.4 性别标记序列  15
  7 粪便DNA 在濒危野生动物保护中的应用  15-17
    7.1 物种鉴定  15
    7.2 个体识别和数量调查  15-16
    7.3 性别鉴定  16
    7.4 亲缘关系的鉴定  16
    7.5 父权的认定  16
    7.6 食性及寄生虫分析  16-17
    7.7 构建指纹图谱  17
    7.8 与GIS 技术的结合  17
    7.9 与免疫分析方法的结合  17
  8 粪便DNA 提取方法  17-19
    8.1 试剂盒提取  18
    8.2 硫氰酸胍（GuSCN）—二氧化硅（SiO_2）法  18
    8.3 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法  18
    8.4 酚/氯仿法  18-19
  9 性别决定基因  19-25
    9.1 SRY 基因的发现与证实  19
    9.2 SRY 基因的定位历史  19-20
    9.3 SRY 基因是TDF 的证实  20
    9.4 SRY 基因的结构与功能  20-21
    9.5 性别鉴定的方法及现状  21-25
  10 本研究的目的意义  25-26
第二章 塔里木马鹿粪便DNA 提取流程的建立  26-38
  1 研究材料  26
    1.1 采集时间和地点  26
    1.2 采集方法  26
  2 试验主要试剂与配置  26-27
  3 主要仪器和设备  27
  4 提取方法  27-31
    4.1 硫氰酸呱（GuSCN）裂解法  27-28
    4.2 CTAB 裂解法  28
    4.3 预处理—酚/氯仿法  28-29
    4.4 粪便DNA 提取试剂盒  29
    4.5 改进后的方法——多管预处理 CTAB+SiO_2 吸附法  29-30
    4.6 陈旧皮张的DNA 提取  30-31
  5 粪便DNA 琼脂糖电泳结果与分析  31-35
    5.1 硫氰酸呱（GuSCN）裂解法的检测结果  31-32
    5.2 CTAB 裂解法检测结果  32
    5.3 预处理-酚/氯仿法检测结果  32-33
    5.4 试剂盒法检测结果  33-34
    5.5 多管预处理 CTAB+SiO_2吸附法  34-35
  6 讨论  35-36
    6.1 粪便DNA 提取的主要困难  35
    6.2 常用粪便提取方法的优点  35-36
  7 结论  36-38
第三章 塔里木马鹿粪便提取的相关因素  38-46
  1 保存方法对粪便DNA 提取的影响  38-43
    1.1 研究材料  39-40
    1.2 研究方法  40-41
    1.3 研究结果  41-42
    1.4 最适条件下粪便DNA 的提取结果  42-43
  2 取样方法对粪便DNA 提取的影响  43-44
  3 预处理对粪便DNA 提取的影响  44
  4 讨论  44-45
  5 结论  45-46
第四章 塔里木马鹿的性别鉴定研究  46-54
  1 研究材料  46
  2 提取方法  46-47
    2.1 血液提取方法  46-47
    2.2 粪便DNA 的提取  47
  3 塔里木马鹿粪便的PCR  47-49
    3.1 PCR 引物  47
    3.2 PCR 扩增  47-48
    3.3 PCR 反应条件  48
    3.4 PCR 产物检测  48-49
    3.5 PCR 结果  49
  4 结果  49-51
  5 讨论  51-54
    5.1 PCR 增强剂的选择  52-53
    5.2 塔里木马鹿种群的性比  53-54
第五章 总结与展望  54-56
  5.1 总结  54-55
  5.2 展望  55-56
参考文献  56-63
攻读学位期间发表的学术论文  63-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物遗传学
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