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去甲斑蝥素诱导结肠癌LS-174T细胞凋亡及其作用机制

作　者: 李猛
导　师: 阎庆辉
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 去甲斑蝥素 AO/EB AnnexinV/PI survivin stat3
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：以人结肠癌LS-174T细胞为研究对象，探讨去甲斑蝥素诱导人结肠癌LS-174T细胞凋亡的作用及其分子机制，为结肠癌的治疗提供实验基础。方法：将人结肠癌细胞株LS-174T细胞于以含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI1640培养基于温度37℃5%CO2温箱中培养，待细胞贴壁，取对数生长期细胞进行试验。采用以下实验：1MTT法检测去甲斑蝥素对LS-174T细胞的生长抑制作用取生长对数期的LS-174T细胞，将其消化成单细胞悬液，调整细胞终浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板中，分别加入质量浓度为5、10、20和40ug/ml的去甲斑蝥素培养，同时设空白组（DMSO溶剂对照组）和阴性对照组（不加药物组）。加药作用24、48、72h，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，于培养箱中继续培养4h，弃上清液，Ascent酶标仪检测D490值，计算细胞生长抑制率,绘制出细胞生长曲线。2荧光显微镜下细胞形态学观察将对数生长期的LS-174T细胞消化，接种于6孔板中进行爬片，培养24h待细胞贴壁生长后，弃去培养液，分别加入质量浓度为10、40ug/ml的去甲斑蝥素，同时设阴性对照组，培养箱中继续培养24h后，迅速置于荧光显微镜下观察，并拍照。3透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化收集0、10、40ug/ml去甲斑蝥素作用24h后的结肠癌LS-174T细胞离心10min，沿管壁加入2.5%的戊二醛，4℃保存，加入1%的锇酸4℃固定,用梯度丙酮脱水，用Epon618纯化树脂浸透，包埋，烤箱中聚合后，用Leica超薄切片机制成切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，用透射电镜观察及拍照。4流式细胞术AnnexinV-FITC/PI染色法收集阴性对照组细胞和药物组（5、10、20、40ug/ml）作用24h后细胞，收集细胞，用预冷PBS重悬细胞，2000rpm离心10min，洗涤细胞，加入300ul Binging Buffer悬浮，加入5ul AnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15min，上机前5min加入5ul PI,上流式细胞仪检测。5Western blot法检测stat-3、survivin、Mcl-1、bax和蛋白表达收集对照组和药物组（5、10、20、40ug/ml）作用24h后细胞，分别加入蛋白裂解液，Bradford法测定蛋白质浓度，每个样品孔加入50ug蛋白，进行12%SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，1%BSA37°C封闭1h，加入1:500稀释的survivin、stat-3、Mcl-1和bax多克隆抗体，室温振荡5h，洗膜后，荧光二抗（抗兔lgG）避光孵育1h，洗膜，发光。结果：1去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞的抑制作用MTT结果表明去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞有明显的生长抑制作用，并且呈时间-剂量依赖性，药物作用组NCTD（5、10、20、40ug/ml）作用24h后，抑制率分别为(9.04±2.4)%、(18.5±3.5)%、(40.1±5.8)%、(58.2±2.7)%；作用72h后，抑制率分别为(18.14±7.4)%、(36.7±4.3)%、(49.9±3.6)%、(72.4±3.1)%（n=3，x±s）。最大抑制率40ug/ml作用72h出现2AO/EB观察细胞形态学变化正常组细胞呈均一绿染；药物组随着药物浓度的增加凋亡率明显增加，10ug/ml药物组细胞体积减小，胞浆减少，细胞核固缩，染色质浓集，凋亡细胞增加；40ug/ml药物组可见细胞核碎裂，以及凋亡小体，出现了典型的“鬼影”细胞3透射电镜观察细胞超微结构的变化阴性对照组细胞，细胞核大、双核且各有一大而明显的核仁，细胞表面有些细长突起，10ug/ml去甲斑蝥素作用24后，细胞微绒毛减少，核体积缩小，核固缩，电子密度增加。40ug/ml去甲斑蝥素作用24h后，核膜破裂，核染色质外排到细胞质中。4流式AnnexinV-FITC/PI染色法分析细胞凋亡率流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI染色法检测药物组和阴性对照组凋亡率，结果显示与阴性对照组相比不同药物浓度（5、10、20、40ug/ml）NCTD作用24h后，细胞凋亡率明显增加，且呈剂量依赖性，各药物组之间凋亡率存在明显差异（P<0.05）5Western blot方法检测stat3、survivin、Mcl-1和bax蛋白的表达阴性对照组和药物组干预组（NCTD5、10、20、40ug/ml）作用24h后，检测stat3、survivin、Mcl-1、bax蛋白表达情况。结果显示：stat3、survivin、Mcl-1蛋白表达减少，bax蛋白表达增加，且随药物浓度的增加表达也增加，呈明显的剂量关系。结论：1去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞具有显著的生长抑制作用，并呈时间--剂量关系2去甲斑蝥素可以通过增加凋亡来抑制结肠癌LS-174T细胞生长3随着NCTD作用浓度的增加stat3、survivin、Mcl-1蛋白表达减少，bax蛋白表达增加，且随药物浓度的增加表达也增加，呈明显的剂量关系，其机制可能是通过抑制stat3途径实现的。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11
材料与方法  11-18
结果  18-20
附图  20-23
附表  23-24
讨论  24-27
结论  27-28
参考文献  28-31
综述 去甲斑蝥素通过不同途径抑癌机制的研究  31-43
  参考文献  36-43
致谢  43-44
个人简历  44

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
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