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肝靶向乳糖化去甲斑蝥素/N-乳糖酰壳聚糖纳米粒的研制

作　者: 胡玮
导　师: 张学农
学　校: 苏州大学
专　业: 药剂学
关键词: 去甲斑蝥素壳聚糖乳糖化双重靶向代谢
分类号: TB383.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）是一种表达在肝实质细胞表面的专一性识别末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白。本课题采用乳糖修饰去甲斑蝥素（Lac-NCTD）与乳糖修饰壳聚糖（GC）为原料制备纳米粒,以期被肝细胞去唾液酸糖蛋白受体识别达到主动靶向和被动靶向双重效果。并对Lac-NCTD及其制剂在大鼠肝微粒体中的代谢进行初步考察,为更进一步的研究提供依据。方法（1）采用离子交联法制备乳糖化去甲斑蝥素/N-乳糖酰壳聚糖纳米粒,以粒径、PDI、包封率、载药量为指标,使用正交设计优化制备处方。（2）通过红外光谱、差示扫描量热分析、X射线衍射和透射电镜等技术,对纳米粒进行质量评价,并考察纳米粒胶体的释放特征。（3）考察纳米粒在H22荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性,通过肿瘤体积增长、抑瘤率、肿瘤病理切片对抗肿瘤活性进行评价。（4）通过MTT法考察Lac-NCTD对肝癌细胞SMMC-7721、HepG 2的半抑制率IC50,为体外细胞摄取实验剂量设置提供依据。（5）采用HPLC法评价肝癌细胞SMMC-7721、HepG2对Lac-NCTD、Lac-NCTD CS NPs、Lac-NCTD GC NPs的摄取作用。（6）通过差速离心法提取大鼠肝微粒体,考察Lac-NCTD及其纳米粒在大鼠肝微粒体中的代谢,求算酶促反应动力学参数。（7）考察选择性CYP酶抑制剂对Lac-NCTD代谢的影响。结果（1）正交优化出的Lac-NCTD GC NPs的制备工艺为:壳聚糖溶液浓度2.5mg·mL^-1、药物载体重量比例25%、温度30℃;采用优化工艺制备的纳米粒包封率（73.82±0.51）%,载药量（13.40±0.08）%,粒径（142.22±5.20）%,PDI（0.121±0.049）。（2）纳米粒形态圆整,粒径与激光粒径测试仪结果一致,不同介质中的释放均符合Higuchi方程。（3）各实验组的抑瘤率与空白组比较均有统计学差异,抑瘤率大小依次为Lac-NCTD-GC-NPs > Lac-NCTD-CS-NPs > Lac-NCTD > NCTD。两种纳米粒都可以增强Lac-NCTD对小鼠肿瘤的抑制作用,经半乳糖修饰的纳米粒更可提高对小鼠实体瘤的抑制作用,反映了其在体内良好的肝靶向分布和抗肿瘤活性。（4）两种纳米粒对肝癌细胞SMMC-7721和HepG 2的亲和力都比Lac-NCTD强,表现出纳米粒的被动靶向作用;Lac-NCTD GC NPs比Lac-NCTD CS NPs具有更高的摄取量,显示出主动靶向作用。（5）原料药和Lac-NCTD GC NPs的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）有差异,且肝内清除率（CLint）比较,原料药组要大于Lac-nctd-NP组（P<0.05）,纳米粒在大鼠肝微粒体中的代谢较原料药组慢,推断Lac-NCTD GC NPs可延缓药物代谢,从而提高生物利用度。（6）CYP3A的特异性抑制剂Ket可以显著的抑制Lac-NCTD的代谢,而其他抑制剂对Lac-NCTD的代谢无明显抑制作用。结论制备的纳米粒粒径均匀,形态圆整,在体外具有缓释特性。乳糖修饰后可有效增加NCTD的抗肿瘤作用,经半乳糖修饰的壳聚糖纳米粒更可提高对小鼠实体瘤的抑制作用,表现出主被动双重靶向作用。肝肿瘤细胞摄入实验结果体现出良好的主动靶向作用。Lac-NCTD GC NPs在体内可延缓药物代谢,从而提高生物利用度。CYP3A的特异性抑制剂酮康唑可以显著的抑制Lac-NCTD的代谢,为进一步药物相互作用研究和进行人肝微粒体试验提供参考。

全文目录

中文提要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-21
第一章纳米粒的制备  21-34
  试药与仪器  21-22
  方法与结果  22-33
    一、乳糖化去甲斑蝥素及N-乳糖酰壳聚糖的制备  22-24
      1 乳糖化去甲斑蝥素的合成  22-23
      2 N-乳糖酰壳聚糖的合成  23-24
    二、纳米粒的制备及质量评价  24-26
      1 去甲斑蝥素N-乳糖酰壳聚糖纳米粒的制备方法  24
      2 纳米粒的质量评价  24
      3. 含量测定  24-26
    三、处方优化  26-28
      1 单因素考察  26-27
      2 正交优化  27-28
    四、优化处方验证  28-29
    五、纳米粒的表征  29-33
      1 纳米粒形态观察  29
      2 纳米粒的结构表征  29-31
      3 纳米粒的体外释放  31-33
  讨论与小结  33-34
第二章小鼠体内的抗肿瘤活性  34-40
  试药与仪器  34-35
  方法与结果  35-39
    一、抑瘤实验方法  35-36
    二、纳米粒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性  36-39
      1 荷瘤小鼠肿瘤生长曲线  36
      2 抑瘤率  36-37
      3 小鼠肿瘤的病理组织学观察  37-39
  讨论与小结  39-40
第三章肿瘤细胞摄入  40-51
  材料与试药  40-41
  方法与结果  41-49
    一、LAC-NCTD 对肝肿瘤细胞的半数抑制率IC_(50)  41-43
      1 LAC-NCTD 对SMMC7721 细胞的IC_(50)  41-42
      2 LAC-NCTD 对HEPG2 细胞的IC_(50)  42-43
    二、肿瘤细胞对纳米粒的摄入  43-49
      1 分析方法建立  43-46
      2 细胞摄取实验  46-49
  讨论与小结  49-51
第四章大鼠肝微粒体中的代谢  51-63
  仪器与试药  51-52
  方法与结果  52-62
    一、大鼠肝微粒体的制备  52
    二、LOWRY 法测定肝微粒体蛋白浓度  52-54
      1 检测波长的确定  52
      2 溶液的配制  52-53
      3 标准曲线  53-54
      4 回收率与精密度  54
      5 大鼠肝微粒体样品中蛋白浓度测定  54
    三、体内含量测定方法的建立  54-57
      1 色谱条件  54
      2 标准溶液的配制  54-55
      3 温孵条件  55
      4 生物样品的处理方法  55
      5 分析方法的专属性  55-56
      6 标准曲线  56
      7 回收率与精密度  56-57
    四、大鼠肝微粒体中LAC-NCTD 代谢的酶动力学  57-61
      1 温孵时间对LAC-NCTD 代谢的影响  57-58
      2 肝微粒体蛋白浓度对LAC-NCTD 代谢的影响  58-59
      3 底物浓度对LAC-NCTD 代谢的影响  59-60
      4 酶促反应动力学参数  60-61
    五、选择性CYP 酶抑制剂对LAC-NCTD 代谢的影响  61-62
  讨论与小结  62-63
全文总结  63-65
参考文献  65-72
攻读硕士学位期间公开发表的论文  72-73
致谢  73-74

肝靶向乳糖化去甲斑蝥素/N-乳糖酰壳聚糖纳米粒的研制

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