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近红外线激光拉曼光谱用于胃癌诊断的研究

作　者: 金少琴
导　师: 毛华
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 近红外线激光拉曼光谱胃癌组织胃癌前病变组织光学诊断
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：胃癌是人类最常见的恶性肿瘤,居世界肿瘤死亡率的第二位,全球每年约有90万胃癌新患者,同时有70万人死于胃癌,全国平均年死亡率为17/10万,居消化道恶性肿瘤的第一位,胃癌5年总体生存率一般在10%左右,是全球范围内5年生存率最差的恶性肿瘤之一,男性的发病率是女性的1.5至2.5倍,任何年龄均可发生,胃癌的发病率随着年龄的增加而显著升高,发病的高峰年龄在50岁至80岁,其预后与分级分期密切相关,早期胃癌不伴淋巴结转移者预后较好,术后5年存活率可达95%,如仅累及粘膜同时有局部淋巴结转移者,5年存活率约82%；如果肿瘤已侵犯浆膜并有转移者,预后较差,因此提高胃癌诊断是减少疾病相关死亡率的最重要措施。在胃恶性肿瘤中,胃癌约占95%以上,目前胃癌的诊断技术(电子胃十二指肠镜技术、影像技术和肿瘤标志物检测等)迅速发展,但最终还是依赖于病理形态学的诊断来确定肿瘤的性质、分化程度和预后等,方法单一,且存在一定的主观性,因此建立一种实时、无损、准确、客观的胃癌诊断方法和技术具有极其重要的意义。拉曼光谱技术的出现为胃癌诊断提供了新的途径,拉曼光谱技术可以直接提供有关分支结构的多种信息,它在蛋白质二级结构的研究、DNA和致癌物分子间的作用等研究中的应用均有文献报道。细胞和组织是由蛋白质、核酸、糖、脂质、辅酶、维生素等成分组成的,细胞或组织发生癌变,是由于生物分子的结构或成分发生了改变,比如DNA、脂类、蛋白质等,结构复杂的生命基本单元每一种生物分子都有其对应的特征拉曼峰。拉曼光谱技术的发展为研究胃癌发生、发展不同病变阶段提供了可能性,而这些生化指标的变化反映到相应拉曼光谱的变化可作为胃癌诊断、预防和疗效判断的可靠指标。近红外线(Near-infrared, NIR)激光拉曼光谱技术(Raman Spectroscopy, RS)作为一种非侵入性的无损检测技术,可以提供丰富的分子结构特征和物质成分信息,通常被称为物质的分子指纹(Molecular Fingerprints, MF),它以物质特定的分子振动光谱来识别和区分不同的物质结构,成为研究物质分子结构的有效手段。生物分子中的部分原子团的结构和键的配置对振动频率很敏感,当分子内部结构发生变化和内部相互作用改变时,都会对拉曼光谱的频率和强度有影响。这表明,生物分子的拉曼光谱中包含着关于这些分子的结构和动力学的信息。近红外拉曼光谱尤其具有吸引力,因为它可以有效消减自体荧光,较深入地穿透进组织、细胞。人体各种组织、细胞的形态和生物功能各不相同,但都是由蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等生物分子组成,每一种物质都有其特征的拉曼光谱。组织和细胞发生癌变总是从构成它们的分子开始,癌变过程中各种生物分子的构型、构象及各成分的构成比例发生变化。这些早期的变化并不引起临床症状和医学影像学的变化,而拉曼光谱对分子的结构、构象及所处的环境很敏感,可反映分子的精细结构、振转结构,能够从分子水平上检测出这些变化,因此与荧光或散射光谱技术相比,拉曼光谱有较高的分子特异性,在癌前病变和早期癌症的诊断方面具有独特优势。同时由于水的拉曼光谱很弱、谱图又很简单,故拉曼光谱可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。在肿瘤生长和发展过程中,组织细胞内的蛋白质、脂类、碳水化合物和核酸等物质结构、构象和数量会发生明显变化,拉曼光谱可以对这些信息变化实现高灵敏度、高分辨率的检测,进而在分子水平上揭示癌变组织与正常组织结构及成分之间的差异,通过对比研究癌组织、癌前病变组织和正常组织的拉曼光谱,从它们之间的差异可发现能反映组织病变信息的特征光谱,从而提供了癌症诊断的依据。拉曼光谱的这些特性使得科研者在肿瘤诊断上展开了广泛应用,目前已有学者对结肠癌,乳腺癌,肝癌,肺癌,鼻咽癌,甲状腺癌等进行了拉曼光谱方面的研究,结果表明,拉曼光谱分析技术在探测与组织病理学相关的分子变化方面具有特别的潜力和优势,并且使无损、实时、准确、高效、客观的光学诊断成为可能,既可以减少组织活检给患者带来的危害,又可以实现实时、有效的诊断,提高患者的生存几率。特别是随着定量及半定量拉曼光谱的发展及在医学领域的应用,为临床上肿瘤的定量诊断奠定了坚实的基础。因此拉曼光谱有望成为恶性肿瘤诊断以及恶性肿瘤癌变机制研究的重要手段,对传统的生物医学分析技术是一个较大的挑战。目的：采用近红外线激光拉曼光谱技术对典型的胃癌、胃癌前病变及正常胃组织样品进行检测采集光谱,对比分析拉曼光谱之间的特异性以及拉曼峰出现波长及峰值变化,以寻找反映改变的光谱特征,并结合对照组病理结果进行验证近红外线拉曼光谱技术可成为胃癌筛查、诊断的新方法,建立一种无损、实时、准确、高效、客观的胃癌光学诊断方法。材料与方法：1、实验仪器与耗材：(1). InVia+Plus型共焦显微拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)(2).双目倒置显微镜(日本OLYMPUS)(3). He-Ne激光器(英国Renishaw公司)(4). Raman-Wire3.2拉曼谱线处理,Matlab数据分析及origin8.5绘图软件(美国Microcal公司)2、实验仪器参数设置：(1)光源：半导体激光器(2)激发光波长：785nm(3)标准输出功率为：300mW,10%激光功率,组织表面激光功率大约10mW(4)抗杂散光性能大于1014(5)入射、出射狭缝宽度：0.15mm(6)扫描步长：0.2nm(7)负高压：8(8)积分时间：150ms(9)系统光谱分辨率为1cm-1(10)20X物镜聚焦激光和收集拉曼光谱信号(11)取谱区间为700-1800cm-1(1300cm-1为中心)实验均在暗室中由同一人检测。3、研究对象收集我院2011年6月至2012年8月行电子胃镜检查并经病理证实的正常胃组织、胃癌前病变组织及胃癌组织共105例。105例受试者均具有完整的临床资料,所有受试者均严格符合上述纳入与排除标准,本研究符合人体试验伦理学标准,得到医院伦理委员会的批准。其中胃癌组织33例,男性23例,女性10例,平均年龄(53.08±10.23)岁。胃癌前病变组织27例,男性19例,女性8例,平均年龄(51.61±9.83)岁。正常胃组织45例,男性23例,女性22例,平均年龄(50.49±9.09)岁。各组年龄无统计学差异。其中胃癌组织中包括低分化腺癌14例,中分化腺癌11例,高分化腺癌8例；胃癌前病变组织中包括萎缩性胃炎伴肠上皮化生化生6例,胃腺瘤性息肉伴低级别上皮内瘤变9例,胃腺瘤性息肉伴高级别上皮内瘤变12例。4、样品采集与保存所有样品离体后立即用生理盐水清洗2-3遍以除去血渍及坏死组织,每一份组织样品均分成两份,每份大小约0.5cm3,一份放入装有10%福尔马林溶液的同一型号的塑料管里面固定,随即贴上标签,然后行常规石蜡包埋,制备成20um厚的连续切片,并行常规HE染色,病理证实；另一份放入冻存管中,随即贴上标签,将其放入液氮罐中保存。标签应注明编号、样品采集时间。如：2011082516(2011年08月25日16时采集)。5、样品处理(1)将装有组织样品的冻存管从液氮罐中取出,置于室温下自然解冻30分钟,再用无菌组织镊将组织样品从冻存管中取出,表面处理平整后置于同一型号的载玻片上(可以忽略载玻片基底的拉曼干涉信号)；(2)把载玻片连同组织样本放在样本台上；(3)调节两个开关使自然光照到样品上；(4)调节控制器移动样品台；(5)用30倍的目镜观察组织样品,使焦点聚集到组织样品上；(6)再次调节两个开关允许激光通过同时屏蔽白光；(7)按设置的参数获得不同波数下的拉曼光谱,重复采集,为实现光谱的重现性,测量过程在2小时之内进行；(8)光谱图输入计算机,再运用Raman-Wire3.2,Matlab及Origin8.5软件进行数据和图谱处理。6、统计分析采用单项方差分析及独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。以上统计分析采用SPSS19.0软件包完成。结果：实验结果表明同类组织样本激光拉曼光谱绝大多数具有较好的重现性,拉曼光谱特征基本相似,而不同类型组织样本的激光拉曼光谱分布存在较大的差异。①典型的拉曼谱峰位于853cm-1,936cm-1,1003cm-1,1032cm-1,1174cm-1,1208cm-1,1323cm-1,1335cm-1,1450cm-1,1655cm-1谱带处,胃癌组、胃癌前病变组及正常组的激光拉曼光谱分布存在差异(p<0.05,单向方差分析,95%可信区间)。和正常组相比,癌前病变组在853cm-1,936cm-1,1003cm-1,1032cm-1,1174cm-1,1208cm-1谱带处显示较低的谱峰强度,而在1323cm-1,1335cm-1,1450cm-1,1655cm-1谱带处则显示较高的谱峰强度。和胃癌组相比,癌前病变组在1323cm-1,1335cm-1,1450cm-1,1655cm-1谱带处则显示较低的谱峰强度,而在936cm-1,1032cm-1,1174cm-1,1208cm-1谱带处显示较高的谱峰强度。②实验谱线中发现有两个反转光谱,分别位于1230cm-1及1250cm-1谱带处。在1230cm-1以下的谱带处,正常组的拉曼光谱强度值高于病变组织(胃癌组及癌前病变组),而在1230cm-1以上的谱带处,正常组的拉曼光谱强度值则低于病变组织(胃癌组织及癌前病变组织)。在1250cm-1以下的谱带处,胃癌前病变组的拉曼光谱强度值高于胃癌组,而在1250cm-1以上的谱带处,胃癌前病变组的拉曼光谱强度值则低于胃癌组,而在700-790cm-1,1000-1008cm-1,1480-1640cm-1谱峰带处,两者比较则显示相反的结果。③拉曼峰强度比值比较：I1003/I1337,I1003/I1450,I1003/I1655,I1174/I1655,健康对照组显著高于胃癌组及胃癌前病变组,三者两两比较差异统计学意义(p<0.05,独立样本t-检验)。④采用PCA-LDA诊断算法得到正常胃组织、胃癌前病变组织及胃癌组织的灵敏度分别是：81.5%,85.3%,100%,特异度分别是：86%,100%,97.4%。采用PCA-NBC技术联合交叉验证方法诊断正常胃组织、胃癌前病变组织及胃癌组织的灵敏度分别是：96.3%,96.9%,96.9%,特异度分别是：93%,100%,95.2%。结论：本课题采用近红外线拉曼光谱技术结合多元统计技术(PCA, LDA, NBC)及拉曼光谱强度比值比较分析了正常胃组织、胃癌前病变组织及胃癌组织的拉曼光谱的差异变化,揭示了与胃组织异型增生及恶性转变有关的特定生化成分在分子水平改变,进一步说明了癌前病变组织是正常组织向癌组织转变的一个过渡阶段,从而提供了胃癌及胃癌前病变诊断的依据,为胃癌的诊断及癌变机理的研究奠定了基础。因此采用近红外线拉曼光谱技术不仅可以有效的鉴别胃癌组织、胃癌前病变组织及正常胃组织,而且对于快速、准确判定胃组织癌变具有较大的潜力。

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摘要  3-10
ABSTRACT  10-20
第一章拉曼光谱用于医学研究的理论基础  20-38
  1.1 拉曼光谱的基本原理  20-23
  1.2 拉曼散射的类型及应用  23-25
  1.3 拉曼散射光谱的优缺点  25
  1.4 拉曼光谱在医学及诊断上的应用  25-30
  1.5 组织样品拉曼光谱影响因素分析  30-35
  1.6 课题研究的主要内容  35-38
第二章胃癌的流行病学与病因学介绍  38-41
  2.1 胃癌的流行病学  38-39
  2.2 胃癌病因学研究  39-41
第三章胃癌、胃癌前病变及正常胃组织的拉曼光谱检测  41-60
  引言  41-43
  3.1 实验材料  43-49
  3.2 实验方法  49-50
  3.3 实验结果  50-56
  3.4 讨论  56-59
  3.5 小结  59-60
参考文献  60-69
中英文对照缩略词表  69-70
硕士就读期间发表的相关论文  70-71
致谢  71-74

近红外线激光拉曼光谱用于胃癌诊断的研究

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