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长非编码RNA BC032469调控胃癌细胞hTERT表达的分子机制研究

作　者: 吕沐瀚
导　师: 杨仕明
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 人端粒酶逆转录酶长链非编码RNA 微小RNA 胃癌
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：胃癌的发生是由不同时期，不同癌基因的激活和/或抑癌基因的失活导致的分子疾病，作用机制可能涉及到不同染色体上多个基因的变化，其中端粒酶的活化在胃癌的发生发展中就具有重要的作用，端粒酶在85%以上的癌组织中表达，而正常的体细胞中不表达或者低表达。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)作为端粒酶的限速亚单位直接决定端粒酶的活性。因此，hTERT的活化导致的端粒酶激活是肿瘤发生发展的重要环节。课题组前期研究发现miR-1182、miR-1266、miR-1207-5p可以从转录后水平调控胃癌细胞hTERT的表达，从而抑制胃癌细胞增殖迁移。而占全部ncRNA转录大部分的长链非编码RNA（long non-ccoding RNA，lncRNA）因其丰富的调控手段在基因转录后的调节中日益受到重视，近来提出了一种全新基因表达调控模式，即竞争性内源性RNA模式（competing endogenous RNAs,ceRNA），也就是说lncRNA、假基因转录物以及mRNA转录物可以竞争性地结合miRNA应答元件(miRNA response element，MRE)来影响基因的转录后调控。本研究的目的在于探索是否存在调控胃癌hTERT的lncRNA，以及它的作用机制。研究方法：(1)采用lncRNA芯片技术筛选可能参与调控hTERT的lncRNA；(2)采用生物信息学技术预测可能调控hTERT的lncRNA；(3)采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)验证筛选的hTERT调控相关的lncRNA；(4)采用特异的lncRNA siRNA化学片段转染细胞，或负载干扰lncRNA序列的慢病毒感染细胞，下调细胞内lncRNA的表达丰度；(5)采用MTT实验、流式细胞仪检测细胞周期、平板克隆形成实验、平面化痕实验、小室侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验对hTERT调控相关的lncRNA进行功能分析；(6)采用生物信息学技术预测可能与lncRNA发生作用的miRNA；(7)使用双荧光素酶实验检测lncRNA和miRNA对hTERT的调控机制；(8)采用Western blot检测lncRNA和miRNA对靶基因hTERT蛋白含量的调控作用；(9)采用TRAP实验检测lncRNA和miRNA对靶基因hTERT蛋白活性的调控作用；(10) Real-time PCR检测过表达lncRNA后，miRNA含量的变化；(11)RNA dot blot实验检测lncRNA与hTERT3’UTR都可以直接结合miRNA。研究结果：一、调控hTERT的lncRNA的预测及鉴定1. lncRNA基因芯片筛查共有4620条lncRNA在hTERT阳性的胃癌组织和hTERT阴性的癌旁正常组织比较中存在显著差异，其中有1134条在hTERT阳性的组织中表达上调超过5倍或以上。2.生物信息学分析预测到了第5对染色体hTERT基因组附近的12条lncRNA，并在5对胃癌及对应癌旁组织中采用Real-time PCR进行验证，共筛选出8条lncRNA在hTERT阳性胃癌组织中表达显著高于hTERT阴性的癌旁胃粘膜组织。将上述8条lncRNA与lncRNA基因芯片的结果进行比对，发现共有3条存在交叉，且差异最为明显的是lncRNA BC032469，表达差异为20.566。二、lncRNA BC032469在胃癌组织中的表达及其临床意义1. Real-time PCR结果显示lncRNA BC032469在癌组织中的表达水平明显高于癌旁胃组织，且lncRNA BC032469在癌和癌旁胃组织中相对含量的比值（C/P）与hTERT蛋白在对应的癌和癌旁胃组织中相对含量的比值（C/P)具有相关性，p<0.01。2.进一步分析lncRNA在58例癌和癌旁胃组织中相对含量C/P比值与肿瘤大小相关（p<0.05）；与肿瘤的分化程度相关（p<0.05）。3.生存分析表明lncRNA BC032469C/P>C/P平均值组的患者术后生存时间较lncRNA BC032469C/P<C/P平均值组有所下降，但无统计学差异，可能与随访时间过短和胃癌术后5年生存率较高有关。三、lncRNA BC032469在胃癌细胞中的功能学研究通过负载shRNA-BC032469慢病毒成功感染MKN28和SGC-7901细胞后，MTT实验表明敲低lncRNA BC032469可明显抑制MKN28和SGC-7901细胞的增殖能力（p<0.01），流式细胞术表明下调lncRNA BC032469可以将MKN28和SGC-7901细胞周期阻滞在G1期；平板克隆形成实验表明下调lncRNA BC032469可抑制SGC-7901细胞克隆形成能力；划痕实验表明下调lncRNA BC032469可抑制MKN28和SGC-7901细胞体外迁移能力；Transwell侵袭实验表明下调lncRNA BC032469对MKN28和SGC-7901细胞体外侵袭能力无影响。裸鼠皮下成瘤实验发现，干扰lncRNA BC032469组的SGC-7901细胞皮下成瘤能力比阴性对照组的成瘤能力下降。四、lncRNA BC032469调控胃癌细胞hTERT表达的分子机制研究1.课题组前期实验寻找到5条与胃癌hTERT调控相关的miRNA（miR-138、miR-491-5p、miR-1182、miR-1207-5p、miR-1266），进一步通过PCR实验验证这5条miRNA在58对胃癌组织和癌旁组织中表达的差异，其中miR-1207-5p、miR-1266在hTERT阴性的的癌旁正常粘膜组织中的丰度显著高于hTERT阳性的的胃癌组织（p<0.05）。2.生物信息学预测到lncRNA BC032469序列上有多个高评分的miR-1266、miR-1207-5p种子区的结合位点。 Western blot结果表示在胃癌细胞中干扰lncRNABC032469能下调hTERT的表达，在此基础上强制表达hTERT ORF区（缺乏hTERT3’UTR）能回复hTERT蛋白的下调。双荧光素酶实验发现： miR-1266、miR-1207-5p可以下调hTERT3’UTR荧光素酶的表达。结合western blot回复实验的结果，干扰lncRNA，可能是通过影响hTERT3’UTR发挥作用。推测也许lncRNABC032469与miR-1266、miR-1207-5p存在相互作用来调控hTERT的表达。3. lncRNABC032469被干扰后，hTERT3’UTR荧光素酶活性降低，同时转染anti-miR-1207-5p对hTERT3’UTR荧光素酶的下调能力显著减弱；同时转染anti-miR-1266未能显著下调hTERT3’UTR荧光素酶的表达。在lncRNA BC032469被干扰的基础上，转染突变了miR-1207-5p结合位点的hTERT3’UTR荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶表达下调的情况显著减弱；转染突变了miR-1266结合位点的hTERT3’UTR荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶表达的下调未受影响。4. Western blot结果表示在干扰lncRNA BC032469的同时，拮抗miR-1207-5p，可以部分地回复hTERT蛋白的下调。而拮抗miR-1266，不能回复hTERT蛋白的表达。5. TRAP实验结果显示干扰lncRNA BC032469，SGC-7901细胞的hTERT活性降低，在干扰lncRNA BC032469的基础上，外源性地拮抗了miR-1207-5p，可以部分地回复hTERT蛋白的活性。6. Real-timePCR发现过表达lncRNABC032469后，miR-1207-5p含量降低，提示lncRNA BC032469可能促进miR-1207-5p的降解。7. RNA dot blot实验发现lncRNA BC032469和hTERT3’UTR都可以直接结合miR-1207-5p，证明lncRNABC032469能竞争结合miR-1207-5p，从而部分解除miR-1207-5p对hTERT的抑制。研究结论：1、通过生物芯片及生物信息学技术，首次证实lncRNA BC032469参与了胃癌细胞hTERT表达的调控，并与胃癌患者的不良预后密切相关；2.功能学研究表明，lncRNA BC032469的敲低可显著抑制胃癌细胞体外增殖、细胞周期、克隆形能力以及迁移能力，抑制胃癌细胞动物体内的增殖能力，在胃癌中起到促癌基因的作用；3. lncRNA BC032469可能通过对miR-1207-5p的封闭，部分解除对hTERT的负性调控，促进hTERT蛋白含量和活性的增高，来促进胃癌细胞增殖和迁移，从lncRNA层面初步阐明胃癌发生发展的新机制，以上研究表明lncRNA BC032469参与了胃癌细胞hTERT表达的调控，并与胃癌的预后密切相关，为胃癌的治疗提供了新的靶点。

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