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DHA联合去甲斑蝥素抑制人胃癌细胞BGC-823增殖及诱导细胞凋亡的研究

作　者: 王晨宇
导　师: 康建省
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 二十二碳六烯酸去甲斑蝥素人胃癌BGC-823细胞细胞培养 bcl-2
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：研究DHA联合去甲斑蝥素体外抗胃癌细胞作用。方法：1实验分组:根据预实验和文献报导用RPMI1640培养基配置4组DHA,终浓度分别为(10、20、30、50mg/mL)，空白组为等体积培养基，对照组为不加处理的细胞，用RPMI1640培养基配置4组用DMSO溶解后的去甲斑蝥素，终浓度为(5、10、20、40μg/mL)，得出各药的半对数抑制浓度(IC50)值，选用均低于单药IC50值的DHA(30mg/mL)联合去甲斑蝥素(5μg/mL),对照组加入含无水乙醇(<0.5％，V/V)和DMSO(<1％，V/V)。2NADH酶组织化学染色:将1×105个BGC-823细胞接种于含盖玻片的6孔板中，使其爬行呈单层贴壁且处于对数生长期，加药继续培养24h，取出盖玻片，冰0.1mol/L PBS溶液冲洗2遍，NADH酶染液孵育液置37℃水浴箱45min，树胶封片显微镜观察。3吖啶橙染色:将1×105个BGC-823细胞接种于含盖玻片的6孔板中，使其爬行呈单层贴壁且处于对数生长期，加药24h后取出盖玻片，冰0.1mol/L PBS溶液冲洗2遍，95%乙醇溶液固定5min，滴加0.01%吖啶橙染液染色1min，荧光显微镜观察并拍照保存。4MTT实验:将培养瓶中处于贴壁生长细胞用0.25%胰蛋白酶混合0.02%EDTA消化，然后利用细胞计数板计数，用1640培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，分装到96孔平底型培养板，每孔加液量100μL，继续培养24h，使细胞呈单层贴壁且处于对数生长期。根据实验分组设计加药，继续培养24h，终止反应时每孔加浓度为2mg/mL的MTT10μL，继续培养4h，弃上清，每孔加二甲基亚砜150μL，酶标仪振荡器摇振10min以使甲瓒产物充分溶解。在波长490nm条件下严格测定A值。其中细胞抑制率计算公式为：(实验组A值/对照组A值)×100%。5流式细胞检测:细胞样品制备:收集24h实验组细胞1×105个/mL，以冰0.01%PBS洗涤细胞2次，重悬于700mL/L预冷乙醇固定，PI一步法染色，流式细胞仪检测亚二倍体峰的比例并拟合细胞周期曲线；PI双标记法检测bcl-2凋亡蛋白，蛋白含量以平均荧光强度表示，平均荧光强度=[lg(X-Mode)]×340。结果：1NADH酶组织化学染色对照组细胞呈正常伸展状态，染色颗粒均匀，胞核规则圆形，位于细胞中央，核膜清楚。经DHA联合NCTD治疗后，可见细胞裂解，胞核分裂、胞膜边界清的凋亡小体，细胞体积缩小，形态不一，胞质颗粒深染，密度增加。核膜核仁破碎，结构更加紧密，细胞核固缩呈均一的颗粒物。2吖啶橙染色对照组细胞呈现典型的肿瘤细胞特征，细胞大小不等，细胞核呈规则的圆形，位于细胞中央。经DHA联合NCTD治疗后，可见细胞胞体肿胀，胞核变形，呈肾形、马蹄形(凋亡小体形成和核破碎)。3DHA和NCTD对人胃癌BGC-823细胞抑制率的影响用MTT法分别测定DHA4个浓度(10、20、30、50mg/mL)和NCTD4个浓度(5、10、20、40μg/mL)对BGC-823细胞作用24h后的抑制率。DHA和NCTD均抑制细胞生长,得出DHA和NCTD的IC50值分别为45.37mg/mL和7.85μg/mL，联合用药组细胞生长抑制率较单药明显升高，作用效果以公式：联合指数(CI)=AB％/A％×B％计算，(CI=1表示相加，小于1表示协同，大于1表示拮抗)。选用均低于单药IC50值的DHA(30mg/mL)联合NCTD(5ug/mL)对细胞抑制率的CI为0.187±0.052(P＜0.01)，说明联合用药的效果是协同作用。4流式细胞检测DHA、NCTD以及DHA联合NCTD处理细胞后在G0/G1期出现明显的亚二倍体凋亡峰，分别为5.3％、6.1％、14.1％，同时3组的细胞凋亡率均高于对照组的细胞凋亡率(3.4％)。拟合细胞周期曲线，对照组、DHA和NCTD的G0/Gl期比例分别为42.3％、53.9％和66.2％，S期的比例分别为55.9％、36.7％和32.5％，而联合组的G0/Gl期上升至68.9％，S期则下降至27.8％。流式细胞检测bcl-2基因蛋白表达显著降低。结论：DHA联合去甲斑蝥素诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡及抑制增殖具有协同作用。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-11
材料与方法  11-18
结果  18-20
附图  20-27
讨论  27-31
结论  31-32
参考文献  32-35
综述 DHA 及去甲斑蝥素体外抗胃癌细胞研究进展  35-43
  参考文献  40-43
致谢  43-44
个人简历  44

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