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人乳头瘤状病毒（HPV）感染和MHC-Ⅰ类分子表达与食管鳞状细胞癌发生关系的研究

作　者: 刘玲
导　师: 李月红；张祥宏
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: HPV E5 食管鳞状细胞癌 PCR MHC-I类分子 IHC
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：人乳头瘤状病毒（Human Papillomavirus, HPV）是一种嗜上皮性的球形DNA病毒，能引起皮肤黏膜的鳞状上皮增生。1978年Harald zurHansen提出HPV可能是性传播致癌的因素，并证实宫颈癌的发生与HPV的直接关系。之后研究者陆续发现HPV可能与直肠癌、食管癌、口腔癌、扁桃体癌等疾病有关。HPV DNA在宿主细胞中有二种存在方式，即整合状态和游离状态（染色体外的附加形式），在癌前组织中病毒常位于染色体外，而在癌症进展期，病毒DNA以单拷贝或多拷贝串联形式整合到宿主细胞DNA中，其结合位点多位于E2基因附近，结果导致HPV E2基因对E6、E7基因启动的负向调节作用缺乏，使E6、E7基因表达异常，导致细胞生长失控。主要组织相容性复合体I（Major HistocompatibilityComplex I，MHC-I)参与内源性抗原（病毒抗原、肿瘤抗原等）加工、处理，其作用是将蛋白抗原处理成抗原肽，呈递给抗原特异性T淋巴细胞，进行抗原抗体反应，清除有害抗原。有研究发现食管癌、胃癌、大肠癌、肺癌、宫颈癌中MHC-I类相关分子蛋白表达下调，本实验室前期研究发现DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）可使食管上皮细胞及人单个核细胞中HLA-I、Calnexin、TAP1、LMP2表达降低。许多病毒可感染人的皮肤和黏膜组织，干扰MHC-I抗原提呈过程，使其逃避宿主免疫应答。恶性肿瘤的发生是多种因素参与的过程，除与病毒感染有关外，机体免疫状况也发挥着重要作用。有研究者发现食管鳞状细胞癌与HPV感染有关，HPV感染人食管鳞状上皮后，其E6、E7致癌基因异常表达，E6可使抑癌基因P53基因失活，而E7则与抑癌基因PRb有关。在宫颈癌发病机制研究中发现高危型HPV的E5基因可以下调MHC-I类分子蛋白表达，抑制肿瘤抗原提呈，使其无法被清除，被认为是宫颈癌的致癌机制之一。但也有学者研究发现在宫颈癌形成后，E5基因丢失，而在宫颈癌前病变中如CINI级中可以检测到E5基因，所以有学者认为E5基因只在癌症发生前起作用。基于以上研究结果，本实验设想E5基因是否影响HPV感染的食管鳞状细胞癌组织中MHC-I分子蛋白表达以及是否通过E5基因而发挥其作用。本课题拟应用聚合酶链反应技术（PCR）、免疫组织化学等方法，对河北省中南部地区食管鳞状细胞癌患者HPV感染情况及抗原提呈过程中相关分子（HLA-a/b/c、Calnexin、TAP1、LMP2）蛋白表达进行分析研究，初步揭示HPV感染对MHC—I类分子蛋白表达的影响和在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用。方法：1标本收集收集河北医科大学第二医院病理科2009-2012年食管鳞状细胞癌与癌旁黏膜石蜡组织112例，要求癌旁黏膜组织未有癌组织侵犯。病例资料包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、家族史（三代以内的近亲）、肿瘤组织学分化程度和是否有淋巴结转移等。2DNA提取应用天根amp FFPE DNA试剂盒提取鳞癌组织和癌旁黏膜DNA，使用Nanodrop2000C(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)仪器鉴定所提DNA纯度。对石蜡包埋组织，取2ul DNA提取液滴加到测定孔处，设定A260：A280值在1.80-2.20被认为污染物少，DNA纯度符合实验要求。3聚合酶链反应（PCR）所有标本提取出的DNA用HPV L1基因扩增，以检测HPV感染情况。并且检测HPV阳性的组织中E5基因扩增情况。4免疫组织化学法免疫组织化学法分别检测鳞癌组织与癌旁黏膜组织中MHC-I分子蛋白表达情况，用光学显微镜对免疫组化结果分析，判断其蛋白表达情况。结果：1本组食管鳞状细胞癌的临床病理特征分析结果统计结果表明，患者年龄、性别、吸烟是食管鳞状细胞癌发生的重要影响因素，112例食管鳞状细胞癌患者中年龄大于50岁、男性和吸烟者所占的比例明显高于小于50岁、女性和不吸烟者。而且进一步的统计分析发现，吸烟和饮酒者HPV的感染率明显高于不吸烟和不饮酒者，差异有统计学意义（P<0.05）。2本组食管鳞状细胞癌组织中HPV感染情况PCR检测结果发现，112例食管鳞状细胞癌标本中有22例检测出了HPV L1基因，本组食管鳞状细胞癌HPV的感染率为19.6%（22/112），其中HPV-16型为感染最多的亚型45.5%（10/22）。3食管鳞状细胞癌组织中MHC-I类分子蛋白表达情况免疫组化结果显示：食管鳞状细胞癌组织中HLA-a/b/c、Calnexin、TAP1和LMP2蛋白阳性表达率分别为36.6%(41/112)、50.0%(56/112)、25.9%(29/112)和42.0%(47/112)，均分别明显低于癌旁黏膜组织表达的阳性率58.0%(65/112)、93.8%(105/112)、77.7%(87/112)和84.8%(95/112)，两者差异均有统计学意义（P<0.05）。4HPV感染对食管鳞状细胞癌组织MHC-I类分子蛋白表达的影响免疫组化结果结果显示：HPV阳性的食管鳞状细胞癌组织中HLA-a/b/c、TAP1蛋白阳性表达率为18.2%(4/22)、45.5%（10/22），明显低于HPV阴性的食管鳞状细胞癌组织41.1%（37/90)、78.9%（71/90），差异有统计学意义（P<0.05）。而Calnexin、LMP2蛋白表达的阳性率在HPV阳性和阴性组的差异无统计学意义（P>0.05）。5HPV E5基因PCR检测结果：在HPV阳性的食管鳞状细胞癌组织及癌旁黏膜组织中，均未检测到E5基因。结论：1本组食管鳞状细胞癌组织中HPV感染率为19.6%，低于中国其他食管癌高发区。提示HPV感染是影响该地区食管鳞状细胞癌发生的因素之一，但不是主要影响因素。2食管鳞状细胞癌中HLA-a/b/c、Calnexin、TAP1和LMP2蛋白表达均明显下调，提示在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中MHC-I类分子抗原提呈过程的异常参与了食管鳞状细胞癌的发生。3HPV阳性组食管鳞状细胞癌组织中HLA-a/b/c、TAP1蛋白表达明显低于阴性组，而Calnexin、LMP2未见明显变化，提示HPV可能主要是通过降低HLA-a/b/c和TAP1蛋白表达影响MHC-I抗原提呈。4HPV阳性的病例中食管鳞状细胞癌和癌旁黏膜组织中均未检测出HPVE5基因，提示在食管组织中HPV感染引起HLA-a/b/c和TAP1蛋白表达降低并不是通过E5基因，可能存在其它机制。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-12
英文缩写  12-13
前言  13-15
材料与方法  15-22
结果  22-25
附图  25-31
附表  31-38
讨论  38-42
结论  42
参考文献  42-47
综述 HPV 致癌机制及研究进展  47-57
  参考文献  52-57
致谢  57-58
个人简历  58

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