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白细胞介素-27促进CIK细胞增殖及杀伤功能实验研究

作　者: 段玉青
导　师: 刘丽华；单保恩
学　校: 河北医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 白细胞介素-27 人外周血单个核细胞细胞因子诱导的活化杀伤细胞细胞增殖杀伤能力
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：初步探讨重组人白细胞介素-27（interleukin-27, IL-27）体外对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）来源的细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer, CIK）细胞增殖及其对肿瘤细胞杀伤功能影响，并探讨其作用机制。方法：1.无菌条件下抗凝抽取健康志愿者外周血20ml，采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，第0天加入IFN-γ（1000U/ml），随后根据加入不同细胞因子剂量随机分为六组进行CIK细胞培养，分别为：A组（IL-2:1000U/ml），B组（IL-2:1000U/ml, IL-27:20ng/ml），C组（IL-2:1000U/ml, IL-27:10ng/ml），D组（IL-2:500U/ml, IL-27:10ng/ml），E组（IL-2:500U/ml, IL-27:20ng/ml），F组（IL-27:20ng/ml）,均种植于抗CD3-抗体（CD3-antibody, CD3-Ab）和纤维连接蛋白（fibronectin, FN）包被的培养瓶中，2-3天视细胞生长情况传代扩增，同时根据上述浓度补加细胞因子IL-2和IL-27。2.倒置相差显微镜下观察各组CIK细胞生长情况及形态学变化。3.通过全自动细胞计数仪计数培养3、5、7、9、11、13天各组CIK细胞数量，分析各组CIK细胞增殖情况。4.通过流式细胞术分别检测培养7、9、11、13天各组CIK细胞CD3+CD56+T细胞、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的表达水平。5.通过MTS方法测定各组CIK细胞对淋巴瘤K562细胞杀伤活性。6.通过RT-PCR方法检测各组CIK细胞干扰素-γ（interference-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）mRNA的表达水平。结果：1.通过倒置相差显微镜下观察到：各组CIK细胞培养第3-5天，细胞体积变大，部分细胞呈梭形生长，各组CIK细胞未见明显差异。培养第7天左右，A组、B组、C组和D组CIK细胞分布密集，体积变大，部分细胞呈集落样生长；E组和F组CIK细胞与A组相比，细胞数量较少，部分细胞体积变小。培养11天左右，A组、B组、C组和D组CIK细胞数量明显增多，细胞透明度明显增加,多呈集落样悬浮生长；E组和F组CIK细胞与A组相比细胞缩小、变圆，细胞数量明显减少。2.全自动细胞计数仪分别计数培养3、5、7、9、11、13天各组CIK细胞数量，结果显示：A组CIK细胞培养13天达增殖高峰，增殖倍数为（3257.73±91.97），B组、C组、D组、E组和F组CIK细胞培养11天增殖倍数达峰值，分别为（3790.92±64.49，4009.85±43.08，4811.87±23.07，2017.31±35.24和1812.78±29.18）。D组CIK细胞培养11天增殖倍数较正常对照组A组培养13天增殖倍数显著性增高，差异具有统计学意义（P <0.05），与B组、C组、E组和F组CIK细胞培养11天相比，D组CIK细胞增殖可见明显差异（P<0.05）。3.流式细胞术检测结果显示：通过组内比较，A组CIK细胞CD3+CD56+T细胞和CD3+CD8+T细胞培养13天表达率最高，分别为（60.03±1.75）%和（62.71±0.69）%，均具有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD4+T细胞培养11天和13天表达率分别为（95.2±1.89）%和（91.6±2.57）%，两者之间无统计学意义（P>0.05），与培养7天及9天相比均具有统计学差异（P<0.05）。B组CIK细胞CD3+CD56+T细胞培养9天表达率为（55.51±0.03）%，培养11天CD3+CD8+T细胞表达率为（74.92±2.47）%，均具有统计学差异（P<0.05）。CD3+CD4+T细胞培养13天表达率为（93.30±1.91）%，与11天比较无统计学差异（P>0.05），与培养7天及9天相比具有统计学差异（P<0.05）。C组CIK细胞CD3+CD56+T细胞培养11天表达率为（56.07±0.83）%，CD3+CD8+T细胞培养13天表达率为（74.43±1.90）%，均具有统计学意义（P<0.05）。CD3+CD4+T细胞培养11天和13天表达率分别为（95.50±1.83）%和（95.50±2.93）%，两者之间不具有统计学差异，与培养7天和9天比较具有统计学差异（P<0.05）。 D组CIK细胞培养11天时CD3+CD56+T细胞和CD3+CD8+T细胞表达率明显较高，分别为（66.57±2.44）%和（81.67±1.97）%，均具有显著性差异（P<0.05），CD3+CD4+T细胞培养11天和13天表达无统计学差异，分别为（97.80±1.44）%和（95.70±1.56）%，与7天和9天相比均具有统计学差异（P<0.05）。通过组间比较发现，D组CIK细胞培养11天CD3+CD56+T细胞表达与正常对照组A组培养13天，B组培养9天及C组培养11天相比均具统计学意义（P<0.05），CD3+CD4+T细胞表达与A组培养11天，B组培养13天及C组培养11天相比均无统计学差异（P>0.05），CD3+CD8+T细胞表达与A组和B组培养11天，C组培养13天相比均具有统计学意义（P<0.05）。4. MTS杀伤实验结果显示，效靶比为10:1、20:1、40:1时，D组CIK细胞培养11天时杀伤率最高，分别为（57.23±5.74）%，（65.27±3.27）%和（76.71±2.21）%，与正常对照组A组CIK细胞培养13天杀伤结果相比均具有统计学意义（P<0.05），与B组和C组CIK细胞培养11天杀伤结果相比具有统计学差异（P<0.05）。5. RT-PCR结果显示，A组、B组、C组和D组CIK细胞培养11天IFN-γ和TNF-α mRNA的表达水平分别为（0.45±0.09，2.77±0.20，2.77±0.16，3.36±0.19）和（0.44±0.08，3.13±0.16，3.09±0.12，3.94±0.73），统计学分析发现B组、C组和D组CIK细胞IFN-γ和TNF-αmRNA的表达水平与正常对照组A组比较均显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05），D组CIK细胞IFN-γ和TNF-α mRNA的表达水平与B组及C组相比具有统计学差异（P<0.05）。结论：1.细胞因子IL-27与IL-2联合应用体外可诱导人外周血单个核细胞来源的CIK细胞的分化成熟，缩短CIK细胞培养时间，最佳培养周期为11天。2.细胞因子IL-27与IL-2联合应用体外可显著提高人外周血单个核细胞来源的CIK细胞增殖能力及对肿瘤细胞的杀伤功能，可能与上调CIK细胞IFN-γ和TNF-α mRNA的表达水平相关。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-18
结果  18-22
附图  22-26
附表  26-28
讨论  28-32
结论  32
参考文献  32-36
综述 IL-27 免疫调节作用研究进展  36-48
  参考文献  43-48
致谢  48-49
个人简历  49-50

白细胞介素-27促进CIK细胞增殖及杀伤功能实验研究

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