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维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响

作　者: 刘玉峰
导　师: 原林
学　校: 南方医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 筋膜学维甲酸成纤维细胞脂肪源干细胞成骨分化
分类号: R681
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：骨组织的损伤与修复一直是临床课题研究的难点与热点。对于骨组织的再生不足的问题,研究者一直期望能够找到适宜的条件或理想的种子细胞来促进骨的再生与修复。2003年原林教授提出的“筋膜学”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架所构成的“支持与储备系统”和以已分化功能细胞为基础的“功能系统”共同构成。支持与储备系统不断的为功能系统的更新和功能活动提供源源不断的营养物质,功能系统在支持与储备系统支持下维持结构与功能的稳定。功能系统的功能发挥要基于已经特化了的功能细胞的基础之上,而支持与储备系统的筋膜支架是以干细胞为核心,通过分化出各种定向干细胞,为功能系统的更新提供源源不断的细胞补充,并为功能系统的各种细胞的更新、代谢提供一个稳定的内部环境。受损组织器官的修复过程实际是支持储备系统中未完全分化的细胞向该组织器官内原有细胞定向分化的补充的过程,并且为功能系统中细胞的新陈代谢提供营养物质,维持其内环境的稳定。间充质细胞的多组织来源与筋膜结缔组织支架的全身分布是一致的,其纵向、横向分化的生物学特性与筋膜学提出的筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。真皮层的成纤维细胞(DFB)及脂肪源干细胞(ADSCs)都是来源于中胚层的间充质细胞,二者在生物学特性及形态上有相似性,且二者都具有一定的定向分化能力。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式,具有多分化潜能,能够跨胚层分化。DFB具有产生纤维(胶原纤维、弹性纤维、网状纤维)与有机质的功能,尤其在组织修复过程中其分泌功能更加明显。ADSCs具有低免疫原性,免疫调节功能和分泌细胞因子等能力为异体移植提供了有利条件,使脂肪源干细胞成为生物治疗的亮点之一。人体参与组织损伤与修复的细胞主要是成纤维细胞与未分化的间充质细胞。骨的损伤修复过程大致可分为血肿的机化,骨痂的形成与塑性三个过程。有研究表明在血肿机化过程中,成纤维细胞也参与了成骨分化的过程。如何能够最大限度发挥成纤维细胞的成骨分化潜能一直是研究者关注的焦点。ADSCs由Zuk等人首次发现并提取培养。与其他成体干细胞比较,ADSCs具有来源广泛、取材方便,创伤小且不存在免疫排斥反应等优点。这类细胞具有较强的增殖能力和多向分化潜能,在适当的诱导条件下能向成脂肪、成软骨、成骨、成肌、成神经及心肌等定向分化。传统成骨诱导液成分(DMEM+10%FBS+1%双抗+1%p甘油酸磷酸钠+0.1%地塞米松+0.5%维生素C)已被证实对成纤维细胞及脂肪源干细胞有一定的成骨诱导分化功能,但其具体机制尚待进一步探索和研究。维甲酸(RA)是体内维生素A的代谢中间产物,有研究表明其对间充质细胞的成骨过程有着重要的调节作用。对维甲酸作为成骨诱导因素的研究发现,维甲酸可以促进胎鼠颅骨闭合和牙齿的生长。国内也有研究发现一定浓度的维甲酸可以成纤维细胞内钙结节的沉积。传统成骨诱导液成分与维甲酸二者对间充质细胞的成骨分化诱导效果与机制是否完全相同,这对于间充质细胞作为骨组织工程种子细胞具有重要的意义。目的通过RA与传统成骨诱导液对DFB与ADSCs两类间充质细胞成骨诱导的对比,进一步了解不同种类间充质细胞在成骨方面的差异,从而为筋膜学提供更多的理论依据,并对骨组织工程在骨的再生与修复方面提供更多实践支持。1、分离并离体培养大鼠ADSCs并对其细胞表面标记物及多向分化潜能进行鉴定；2、分离并离体培养大鼠皮肤DFB并对其进行波形蛋白鉴定；3、分别使用RA与传统成骨诱导液对两类细胞进行为期2周的成骨诱导,检测各项细胞生长指标,如细胞生长曲线,骨碱性磷酸酶活性,茜素红染色,RT-PCR检测骨钙素的表达,分析差异。方法1、取5-7d龄的SD乳鼠背部皮肤,酶消化法分离、培养DFB。通过形态学、免疫组化等手段来鉴定其是否为成纤维细胞。2取同只乳鼠的腹股沟脂肪垫,酶消化法分离培养ADSCs。通过形态学,流式细胞学及多向诱导分化实验鉴定其是否为ADSCs。3、待细胞分别培养并传至第3代,用0.25%胰酶消化下来,用完全培养基重悬,并调整密度为5×104/ml接种于六孔板内。分别用传统成骨诱导液与RA诱导2周,每孔2ml细胞悬液。本课题组前期的实验研究发现,RA对DFB及对ADSCs诱导影响最大的浓度为10-5mol/L。本实验共分为6组：DFB空白族,DFB传统组,DFB维甲酸组,ADSCs空白组,ADSCs传统组,ADSCs维甲酸组。4、在诱导过程中选取0d、3d、7d、14d、4个时间点绘制各组细胞生长曲线。2周后对各组细胞进行茜素红染色,骨碱性磷酸酶活性的测定,RT-PCR检测骨钙素的表达情况。5、统计学方法采用SPSS13.0统计软件处理,实验数据用均数士标准差表示,采用单因素方差分析,分析对比差异。结果1、原代DFB接种到培养瓶内48h内逐渐贴壁,开始细胞数量较少,生长缓慢,3d后细胞换液。5-7d后细胞大量生长,镜下细胞呈梭形或者多角形,排列紧密,呈旋涡状。将细胞传至3代。DFB波形蛋白免疫荧光鉴定,镜下蓝色为DAPI染的胞核部分,绿色为FITC荧光标记,显示波形蛋白。2、原代ADSCs接种到培养瓶内48h内逐渐贴壁,开始细胞数量较少,生长缓慢,3d后细胞换液。5-7d后细胞大量生长,镜下细胞与成纤维细胞形态学相似,呈梭形或者多角形,细胞排列紧密。ADSCs通过流式细胞仪检测鉴定,脂肪源干细胞表面标记,CD29阳性,CD106阴性,CD49d阴性。体外诱导可向成骨、成脂肪分化。3、从细胞生长曲线图中我们可以看出,诱导因素的加入减缓了各诱导组细胞的增殖速度。空白组细胞的增殖速度都高于本类细胞的实验组。4、DFB与脂ADSCs经2周的统成骨诱导与RA诱导后,茜素红染色均有明显的钙结节着色,而各自的空白对照组则未见着色。各类细胞组间骨碱性磷酸酶检测(p<0.05)有统计学差异。5、RT-PCR检测结果显示各干预组均有骨钙素的表达,空白组则未见表达。结论1、来源于DFB与ADSCs都具有长梭形、多角形的形态学特征,可以形成细胞集落,形态学上无明显差异；DFB经免疫荧光鉴定有大量阳性细胞,可以判定该类细胞绝大多数为真皮层来源的成纤维细胞。。2、ADSCs表面标记物检测中,特异性表面标志物CD29表达率分别为90%以上,而CD49d阴性表达,而CD106弱表达阳性,说明该类细胞具有干细胞特征的表面标记物,且又不是来源于造血系和上皮系的组织,该类细胞经定向诱导后可以成骨、成脂肪,与间充质干细胞多向分化的功能一致。可以判断在脂肪垫筋膜结缔组织中存在未分化间充质干细胞。3、DFB与ADSCs在传统成骨诱导与RA诱导的情况下,细胞内均有钙结节的沉积,并且两类细胞与各自的空白对照组相比骨碱性磷酸酶活性均有显著升高(p<0.05)。在DFB组中,RA诱导的骨碱性磷酸酶活性比传统成骨诱导高,而在ADSCs组中,结果却相反。4、RT-PCR检测结果显示各干预组均有不同程度的骨钙素表达。综上所述,RA与传统成骨诱导液均可以促进DFB及ADSCs的成骨分化,并且因细胞种类不同而显著效果不同,其发生机制仍有待进一步探索研究。筋膜学认为,以干细胞为核心的支持储备系统在人体正常生理活动、损伤与修复过程中发挥着重要的作用,它以自身的不断再生与更新,源源不断地为功能系统提供必要的营养物质以维持人体各项生理功能。人体的结缔组织属于支持持储备系统的范畴,在结缔组织中蕴含着丰富的成纤维细胞与各种成体干细胞,因此对支持储备系统功能完全透彻的理解必将对组织损伤与修复有一个全新的认识。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-18
第一章脂肪源干细胞的培养及鉴定  18-30
  1 材料和方法  18-23
  2 结果  23-24
  3 讨论  24-26
  4 结论  26
  参考文献  26-28
  附图  28-30
第二章真皮成纤维细胞的培养及鉴定  30-38
  1 材料和方法  31-34
  2 结果  34
  3 讨论  34-36
  参考文献  36-37
  附图  37-38
第三章维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响  38-51
  1 材料和方法  38-44
  2 结果  44-46
  3 讨论  46-48
  参考文献  48-50
  附图  50-51
中英文对照缩略词表  51-52
成果  52-53
致谢  53-55

维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响

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